脂多糖影響GLUTag細(xì)胞gcg mRNA表達(dá)的分子機(jī)制.pdf

1、背景：隨著人們生活水平的提高及生活方式的改變，2型糖尿病的發(fā)病率在我國呈現(xiàn)出高速發(fā)展的趨勢(shì)。據(jù)2009年最新數(shù)據(jù)顯示，我國2型糖尿病的發(fā)病率已達(dá)到9.7％，總患病人數(shù)9240萬，躍居世界第一位。糖尿病所引起各種急慢性并發(fā)癥，導(dǎo)致多系統(tǒng)組織器官功能障礙，嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量和壽命，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。腸促胰素(incretins)這一概念最早由La Barre于1932年提出，是指腸道衍生物具有食物依賴性促胰島素

2、分泌作用的肽類激素。胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素多肽（glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP）是人體最重要的2種腸促胰素。GLP-1是腸道L細(xì)胞分泌的一種重要的腸肽激素，可葡萄糖依賴性的促進(jìn)胰島素合成分泌，促進(jìn)β細(xì)胞增殖、抑制β細(xì)胞凋亡等作用。目前已經(jīng)證實(shí)，GLP-1除了葡萄糖依賴性的促進(jìn)胰島素的分泌外，還

3、具有抗炎活性、抗氧化應(yīng)激及改善內(nèi)皮細(xì)胞功能等多種優(yōu)勢(shì)，腸促胰素的發(fā)現(xiàn)使2型糖尿病在發(fā)病機(jī)制和治療上取得了突破性的進(jìn)展。然而，在2型糖尿病患者中腸促胰素效應(yīng)卻是明顯受損或缺失的，這究竟是糖尿病所導(dǎo)致的一種后果，還是其本身就是糖尿病發(fā)生的一個(gè)重要機(jī)制，目前尚未有研究證實(shí)。早期研究就發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者口服葡萄糖后，腸促胰素刺激胰島素分泌的作用較健康對(duì)照者減弱，主要表現(xiàn)為GIP的作用缺陷以及GLP-1的分泌減少。隨后研究發(fā)現(xiàn)在肥胖的2型糖尿病患

4、者腸促胰素效應(yīng)的受損普遍比較瘦的患者嚴(yán)重，可能包括腸促激素的分泌不足、效應(yīng)以及代謝異常等因素。有研究者比較了2型糖尿病患者中GIP及GLP-1受損的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)GIP分泌受損較輕，而GLP-1的分泌功能受損卻很嚴(yán)重，無論是總的或者是有活性的GLP-1的水平都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常對(duì)照人群。GLP-1分泌減少是2型糖尿病患者腸促胰素效應(yīng)受損的主要特點(diǎn)，而腸道L細(xì)胞的早期損傷或凋亡可能是GLP-1分泌減少的主要原因并參與了2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。然而，

5、目前的研究主要關(guān)注不同藥物在腸道內(nèi)源性GLP-1分泌的調(diào)節(jié)作用，鮮有針對(duì)腸道L細(xì)胞的功能狀態(tài)的研究。隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及細(xì)菌培養(yǎng)等技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究表明腸道菌群對(duì)宿主代謝以及免疫功能，甚至代謝病如肥胖、糖尿病的發(fā)生發(fā)展都有著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者腸道內(nèi)的微生物菌群的構(gòu)成明顯改變。其硬壁菌門數(shù)量明顯降低，而擬桿菌門的數(shù)量顯著增加。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)作為革蘭陰性桿菌如擬桿菌門的

6、細(xì)胞壁的主要成分，經(jīng)過細(xì)菌不斷的繁殖與分解，在腸道內(nèi)持續(xù)的產(chǎn)生，機(jī)體從腸道中吸收更多的LPS，使體內(nèi)血清LPS水平增高，同時(shí)腸腔內(nèi)持續(xù)升高的LPS濃度勢(shì)必亦對(duì)位于遠(yuǎn)端腸道散在分布的內(nèi)分泌L細(xì)胞的功能產(chǎn)生損害。編碼GLP-1的基因被稱為胰高血糖素原基因(gcg)，是上世紀(jì)80年代才從嚙齒類動(dòng)物和人類中分離得到。研究發(fā)現(xiàn)位于gcg基因啟動(dòng)子區(qū)域的啟動(dòng)子G1以及四個(gè)增強(qiáng)子G2-G5對(duì)gcg轉(zhuǎn)錄具有重要調(diào)控作用。經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用

7、的效應(yīng)因子是轉(zhuǎn)錄因子β-catenin，其活性為β-catenin與TCF轉(zhuǎn)錄因子（TCF-1，LEF-1，TCF-3和TCF7L2）結(jié)合的二聚體形式，在腸道上皮細(xì)胞中，β-catenin主要與TCF7L2結(jié)合。在非刺激狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)游離的β-catenin的濃度由蛋白酶體介導(dǎo)的降解體系嚴(yán)密調(diào)控。在Wnt刺激下，細(xì)胞內(nèi)β-catenin聚集，致使β-catenin/TCF二聚體形成從而激活其下游靶基因。近年來，研究證實(shí)腸道L細(xì)胞gcg基

8、因的表達(dá)可由Wnt信號(hào)通路調(diào)控。二聚體β-catenin/TCF與gcg基因增強(qiáng)子G2內(nèi)部分序列結(jié)合從而調(diào)控gcg基因轉(zhuǎn)錄。LPS一旦與其受體結(jié)合通過激活NADPH氧化酶途徑，使細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增加。細(xì)胞內(nèi)ROS水平少量升高，都可刺激FOXOs轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，使其轉(zhuǎn)錄活性增加。2005年，Essers et al.發(fā)現(xiàn)了FOXO蛋白也可與β-catenin結(jié)合，這種結(jié)合方式具

9、有高度的進(jìn)化保守性，并且在氧化應(yīng)激存在的情況下，它們的結(jié)合大大增加。在結(jié)腸癌細(xì)胞、骨間充質(zhì)干細(xì)胞中已經(jīng)得到證實(shí)FOXO蛋白與β-catenin相互作用可以明顯抑制β-catenin/TCF調(diào)控的基因表達(dá)。本研究旨在探討LPS是否通過刺激ROS產(chǎn)生增加FOXO與β-catenin結(jié)合，從而抑制在L細(xì)胞中β-catenin/TCF調(diào)控的gcg基因表達(dá)。因此，本課題以腸道內(nèi)分泌L細(xì)胞株GLUTag細(xì)胞為研究對(duì)象，擬從以下幾個(gè)方面進(jìn)行初步探討:

10、1、觀察LPS對(duì)GLUTag細(xì)胞ROS生成以及對(duì)gcg mRNA表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。2、探討LPS是否通過FOXO4基因而影響gcg mRNA的表達(dá)，并觀察此影響是否通過Wnt信號(hào)通路起作用。為進(jìn)一步闡明2型糖尿病體內(nèi)GLP-1分泌減少的分子機(jī)制以及探索新的糖尿病治療靶點(diǎn)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分：脂多糖對(duì)GLUTag細(xì)胞gcg mRNA表達(dá)的影響。
　　 目的：探討脂多糖對(duì)GL

11、UTag細(xì)胞gcg mRNA表達(dá)及其可能的作用機(jī)制。
　　 方法：⑴GLUTag細(xì)胞的培養(yǎng):以含10％胎牛血清的DMEM（低糖）完全培養(yǎng)基在37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。2天換液一次。⑵不同濃度LPS對(duì)GLUTag細(xì)胞ROS水平的影響:用6孔板鋪板GLUTag細(xì)胞，用無血清DMEM（低糖）培養(yǎng)基預(yù)處理，37℃、5％ CO2中培養(yǎng)6h，使其處于同步化狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)分為4組:空白對(duì)照組（簡(jiǎn)稱Ctrl組），即細(xì)胞用不含脂多糖的DM

12、EM培養(yǎng)基培養(yǎng);含10ng/ml脂多糖組（簡(jiǎn)稱10ng/ml組），細(xì)胞培養(yǎng)于含有終濃度為10ng/ml脂多糖的DMEM培養(yǎng)基;含100ng/ml脂多糖組（簡(jiǎn)稱100ng/ml組），細(xì)胞培養(yǎng)于含有終濃度為100ng/ml脂多糖的DMEM培養(yǎng)基;含500ng/ml脂多糖組（簡(jiǎn)稱500ng/ml組），細(xì)胞培養(yǎng)于含有終濃度為500ng/ml脂多糖的DMEM培養(yǎng)基。各組細(xì)胞在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞用DHE探針標(biāo)記，分別用細(xì)

13、胞免疫熒光法以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。⑶不同濃度LPS對(duì)GLUTag細(xì)胞gcg mRNA表達(dá)的影響:分組及培養(yǎng)條件同上，用熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)gcg mRNA的表達(dá)。⑷apocynin對(duì)GLUTag細(xì)胞ROS水平以及gcg mRNA表達(dá)的影響:細(xì)胞于6孔板中鋪板，用無血清DMEM（低糖）培養(yǎng)基預(yù)處理，37℃、5％ CO2中培養(yǎng)6h，使其處于同步化狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)分為4組:空白對(duì)照組;Apo組:600μM apocynin處理細(xì)胞

14、1h;100ng/ml LPS組;Apo+LPS組:細(xì)胞用600μM apocynin處理1h再用100ng/ml LPS處理24h，各組按實(shí)驗(yàn)要求收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，用熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)gcg mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①不同濃度LPS對(duì)GLUTag細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響:熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組與10ng/ml LPS組中紅色熒光強(qiáng)度微弱，而100ng/ml LPS組熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)

15、，用500ng/ml LPS處理細(xì)胞后紅色熒光強(qiáng)度在四組中最強(qiáng)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，正常對(duì)照組熒光強(qiáng)度較低（31.00±4.65），100ng/ml組和500ng/ml組細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增高，分別高達(dá)52.17圭4.09和67.13±4.46（P＜0.001和P＜0.001），10ng/ml組ROS水平輕度升高為32.47±2.77，與正常對(duì)照組相比無顯著性差異(P=0.670)。四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=54.127，P＜0.0

16、01)。②不同濃度LPS對(duì)GLUTag細(xì)胞gcg mRNA表達(dá)的影響:空白對(duì)照組的2-△△Ct值為0.99±0.11，10ng/ml LPS組為0.98±0.11，兩組間無顯著性差異(P=0.828)。100ng/ml LPS組和500ng/ml LPS組的的2-△△Ct值分別為0.49±0.07和0.24±0.03，與對(duì)照組相比明顯降低，四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=113.354，P＜0.001)。③apocynin對(duì)LPS作用GLU

17、Tag細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)ROS水平以及gcg mRNA表達(dá)的影響:加入apocynin預(yù)處理組與不加抑制劑的LPS組相比，細(xì)胞內(nèi)ROS水平由52.17±4.09下降至37.7±5.76，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.024)。同時(shí)，gcg mRNA表達(dá)水平從0.49±0.07上升到0.88±0.06，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 結(jié)論：隨著LPS濃度的升高，可以使GLUTag細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升，而gcg mRNA表達(dá)相應(yīng)的下降

18、，并且NADPH氧化酶抑制劑apocynin可以阻抑這一作用。提示LPS刺激引起的ROS可能與內(nèi)分泌L細(xì)胞gcg mRNA表達(dá)下降有關(guān)。
　　 第二部分：脂多糖抑制GLUTag細(xì)胞gcg mRNA表達(dá)的分子機(jī)制探討。
　　 目的：探討轉(zhuǎn)錄因子FOXO4對(duì)GLUTag細(xì)胞gcg mRNA表達(dá)的影響，進(jìn)而了解脂多糖抑制GLUTag細(xì)胞gcg mRNA表達(dá)的可能分子機(jī)制。
　　 方法：⑴FOXO4基因?qū)LUTag細(xì)胞

19、gcg mRNA表達(dá)的影響:用24孔板鋪板GLUTag細(xì)胞，用無血清DMEM（低糖）培養(yǎng)基預(yù)處理，37℃、5％ CO2中培養(yǎng)6h，使其處于同步化狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)分為4組:空白對(duì)照組（簡(jiǎn)稱Ctrl組），細(xì)胞用不含脂多糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h;含100ng/ml脂多糖組（簡(jiǎn)稱LPS組），細(xì)胞用含有終濃度為100ng/ml脂多糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h;轉(zhuǎn)染shFOXO4過表達(dá)質(zhì)粒組（簡(jiǎn)稱shFOXO4組），細(xì)胞轉(zhuǎn)染shFOXO4過表達(dá)質(zhì)粒2

20、4h后，用不含脂多糖的DMEM培養(yǎng)基再培養(yǎng)24h;轉(zhuǎn)染siRNA-FOXO4小干擾RNA組（簡(jiǎn)稱si-FOXO4組），細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-FOXO4小干擾RNA片段24h后，用含有終濃度為100ng/ml脂多糖的DMEM培養(yǎng)基再培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞用熒光定量PCR檢測(cè)gcg mRNA表達(dá)。⑵不同濃度LPS對(duì)二聚體β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄因子活性的影響:用24孔板鋪板GLUTag細(xì)胞，用無血清DMEM（低糖）培養(yǎng)基預(yù)處理，37℃、5

21、％ CO2中培養(yǎng)6h，使其處于同步化狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)分為4組:空白對(duì)照組（簡(jiǎn)稱Ctrl組），含100ng/ml脂多糖組（簡(jiǎn)稱LPS組），50ng/ml重組蛋白Wnt3a組（簡(jiǎn)稱Wnt3a組），含50ng/ml重組蛋白Wnt3 a+100ng/ml脂多糖組（簡(jiǎn)稱100ng/ml組）。用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄因子活性。⑶FOXO4對(duì)二聚體β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄因子活性的影響:GLUTag細(xì)胞用24孔板鋪板，用無血

22、清DMEM（低糖）培養(yǎng)基預(yù)處理，37℃、5％CO2中培養(yǎng)6h，使其處于同步化狀態(tài)。在轉(zhuǎn)入pTOPFLASH熒光素酶報(bào)告基因的同時(shí)，共同轉(zhuǎn)入shFOXO4過表達(dá)質(zhì)?；蛐「蓴_RNA si-FOXO4。實(shí)驗(yàn)分為4小組:空白對(duì)照組（簡(jiǎn)稱Ctrl組），含100ng/ml脂多糖組（簡(jiǎn)稱LPS組），轉(zhuǎn)染shFOXO4過表達(dá)質(zhì)粒組（簡(jiǎn)稱shFOXO4組），轉(zhuǎn)染siRNA-FOXO4小干擾RNA組（簡(jiǎn)稱si-FOXO4組）。四組分別在重組蛋白Wnt3a存

23、在或不存在的情況下用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄因子活性。⑷LPS對(duì)GLUTag細(xì)胞FOXO4/β-catenin以及TCF7L2/β-catenin二聚體形成的影響:實(shí)驗(yàn)分為4組:空白對(duì)照組（簡(jiǎn)稱Ctrl組），50ng/ml重組蛋白Wnt3a組（簡(jiǎn)稱Wnt3a組），含100ng/ml脂多糖組（簡(jiǎn)稱LPS組），含50ng/ml重組蛋白Wnt3a+100ng/ml脂多糖組（簡(jiǎn)稱Wnt3a+LPS組）。用蛋白質(zhì)免疫共沉淀

24、技術(shù)分別檢測(cè)anti-FOXO4和anti-TCF7L2抗體沉淀下來的蛋白中β-catenin的表達(dá)水平，計(jì)算蛋白相對(duì)灰度值。
　　 結(jié)果：①FOXO4基因?qū)LUTag細(xì)胞gcg mRNA表達(dá)的影響:與正常對(duì)照組（0.99±0.11）相比，LPS作用細(xì)胞后gcg mRNA表達(dá)為0.49±0.07(P＜0.001)，而GLUTag細(xì)胞轉(zhuǎn)染shFOXO4過表達(dá)質(zhì)粒后，其gcg mRNA表達(dá)也下降至0.41±0.05(P＜0.001

25、)。而si-FOXO4組比LPS組gcg mRNA表達(dá)上升至0.80±0.08(P＜0.001)。四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=72.180，P＜0.001)。②LPS對(duì)二聚體β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄因子活性的影響:熒光光度計(jì)檢測(cè)各組間相對(duì)熒光素酶單位(RLU)值用析因方差分析，LPS與重組蛋白Wnt3a兩種干預(yù)之間有交互作用(F=81.389，P＜0.001)。LPS組RLU值（0.17±0.01）明顯低于Ctrl組（0.26±0

26、.01）(P＜0.001)。而用Wnt3a處理細(xì)胞24h，接著用100ng/ml LPS處理后，RLU值與Wnt3a處理組相比（0.74±0.01）上升至0.47±0.03(P＜0.001)。③FOXO4對(duì)二聚體β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄因子活性的影響:各組RLU值之間有顯著差異(F=47.950，P＜0.001)。與對(duì)照組相比（0.26±0.01），shFOXO4組與LPS組都使RLU值下降，分別達(dá)0.13±0.02和0.17±0

27、.01（P＜0.001和P＜0.001）。而siFOXO4組與LPS組相比RLU值從0.17±0.01升高至0.23±0.02(P=0.001)。在重組蛋白Wnt3a存在的條件下，各組間RLU值有顯著差異(F=145.072，P＜0.001)。shFOXO4組和LPS組分別使RLU值從0.74±0.01下降至0.38±0.03和0.47±0.03，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001和P＜0.001）。轉(zhuǎn)入si-FOXO4干擾后，LPS組的

28、RLU值上升達(dá)到0.57±0.02(P＜0.001)。④LPS對(duì)GLUTag細(xì)胞FOXO4/β-catenin以及TCF7L2/β-catenin二聚體形成的影響：免疫共沉淀方法檢測(cè)anti-FOXO4抗體沉淀下來的蛋白中β-catenin表達(dá)水平用析因方差分析，LPS與重組蛋白Wnt3a兩種干預(yù)之間有交互作用(F=47.365，P＜0.001)。與正常組相比（1.00±0.04），LPS組與轉(zhuǎn)錄因子FOXO4結(jié)合的β-catenin增

29、多至1.68±0.07(P＜0.001)。Wnt3a+LPS組與Wnt3a組相比，與FOXO4結(jié)合的β-catenin從1.30±0.06增加至2.43±0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)；免疫共沉淀方法檢測(cè)anti-TCF7L2抗體沉淀下來的蛋白中β-catenin表達(dá)水平用析因方差分析，LPS與重組蛋白Wnt3a兩種干預(yù)之間無交互作用(F=0.062，P=0.809)。與正常組相比（1.00±0.03），LPS組與轉(zhuǎn)錄因子

30、TCF7L2結(jié)合的β-catenin減少至0.62±0.08(P=0.002)。Wnt3a+LPS組與Wnt3a組相比，與TCF7L2結(jié)合的β-catenin從1.77±0.11減少至1.37±0.10，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)。
　　 結(jié)論：LPS可能是通過FOXO4干預(yù)了二聚體β-catenin/TCF活性，其機(jī)制可能是通過FOXO4和TCF7L2競(jìng)爭(zhēng)與β-catenin蛋白結(jié)合，從而抑制Wnt信號(hào)通路活性，最終抑