脂多糖對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的影響及調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的:通過(guò)組織塊法分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umibilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs),并用不同濃度脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)刺激細(xì)胞,探討 LPS對(duì) hUCMSCs細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其調(diào)控機(jī)制。研究低濃度LPS預(yù)處理對(duì)hUCMSCs的適應(yīng)性保護(hù)作用,并探討其潛在機(jī)制,為增強(qiáng)hUCMSCs的內(nèi)毒素耐受性提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:

2、1、利用組織塊法從足月兒臍帶中分離培養(yǎng) hUCMSCs。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);MTT法檢測(cè)第3、5、10代細(xì)胞增殖活性;免疫熒光染色法測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)記物。
　　2、采用不同濃度LPS(0、0.01、0.1、1.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μg/ml)刺激hUCMSCs。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性;AO/EB染色法及流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;酶聯(lián)免疫吸附法( enz

3、yme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)Caspase-8、Caspase-3活性及DNA片段。
　　3、低濃度LPS(0.1、1.0、10.0、20.0μg/ml)預(yù)處理12h后,再給予hUCMSCs50.0μg/ml LPS作用24h。FCM及Hoechst染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。
　　4、低濃度LPS(0.1、1.0、10.0、20.0μg/ml)預(yù)處理

4、12h,或再給予hUCMSCs50.0μg/ml LPS作用24h,或給予si-FLIPL及NF-κB特異性抑制劑PDTC,Western blot檢測(cè)c-FLIPL和NF-κBp65蛋白表達(dá)變化情況;FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化情況;ELISA檢測(cè)Caspase-8、Caspase-3活性變化情況。
　　結(jié)果:1、組織塊法分離培養(yǎng)出成纖維樣細(xì)胞,呈貼壁漩渦樣生長(zhǎng)。第3、5、10代細(xì)胞增殖快速,趨勢(shì)皆呈“S”型。細(xì)胞高表達(dá)CD105、C

5、D90、CD73和CD44,低表達(dá)HLA-I;不表達(dá)CD31、CD45和HLA-DR。
　　2、MTT結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,0.01-10.0μg/ml LPS干預(yù)組吸光度值(A值)明顯增高(P<0.05或P<0.01),其中1.0μg/ml LPS干預(yù)組最高(P<0.01);而20.0μg/ml LPS干預(yù)組無(wú)明顯變化(P>0.05),30.0-50.0μg/ml LPS干預(yù)組A值明顯降低(P<0.01)。AO/EB示,0-1

6、0.0μg/ml LPS干預(yù)組未見(jiàn)明顯凋亡細(xì)胞,20.0-50.0μg/ml LPS干預(yù)組可見(jiàn)明顯細(xì)胞凋亡。FCM示:與對(duì)照組〔(2.68±0.27)％〕比較,1.0μg/ml LPS干預(yù)組細(xì)胞凋亡率〔(3.07±0.35)%〕無(wú)明顯差異(P>0.05),而30.0及50.0μg/ml LPS干預(yù)組凋亡率〔(8.92±3.77)%、(23.46±2.38)%〕明顯增高(P<0.01)。ELISA結(jié)果示:50.0μg/ml LPS明顯提高

7、了hUCMSCs Caspase-8、Caspase-3活性及DNA片段化程度(P<0.01),但Caspase-8抑制劑z-IETD-FMK可顯著降低其水平(P<0.01)。
　　3、FCM結(jié)果示:與未預(yù)處理組比較,0.1和1.0μg/ml LPS預(yù)處理組hUCMSCs細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.01),而10.0和20.0μg/ml LPS預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化(P>0.05)。Hoechst染色顯示,1.0μg/ml

8、LPS預(yù)處理可顯著降低50.0μg/ml LPS引起的細(xì)胞凋亡。MTT結(jié)果示,1.0μg/ml LPS預(yù)處理可使50.0μg/ml LPS引起的 hUCMSCs存活率從(62.42±6.62)%上升至(84.15±6.30)%(P<0.01)。
　　4、與對(duì)照組比較,0.1和1.0μg/ml LPS預(yù)處理組hUCMSCs中c-FLIPL蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01);且1.0μg/ml LPS預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)50.0μg/ml LP

9、S誘導(dǎo)的c-FLIPL蛋白表達(dá)下降(P<0.01)。si-FLIPL可顯著降低1.0μg/ml LPS預(yù)處理引起的c-FLIPL高表達(dá)水平(P<0.01),并減弱1.0μg/ml LPS預(yù)處理抗細(xì)胞凋亡的能力。PDTC可同時(shí)下調(diào)1.0μg/ml LPS預(yù)處理引起的NF-κBp65和c-FLIPL高表達(dá)水平(P<0.01)。
　　結(jié)論:通過(guò)組織塊法從人臍帶中成功分離、培養(yǎng)出 hUCMSCs。LPS對(duì)hUCMSCs細(xì)胞增殖具有濃度依賴