人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠燒傷治療作用及其機(jī)制.pdf

1、目的：觀察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠燒傷治療作用，并探求其機(jī)制。
　　 方法：⑴分離純化人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)，選用180～220g雄性SD大鼠，隨機(jī)分為燒傷后對(duì)照組及燒傷后UC-MSCs移植治療組，復(fù)合麻醉劑腹腔注射麻醉后制備大鼠燒傷模型；觀察兩組大鼠燒傷后的創(chuàng)面愈合情況及其愈合率，同時(shí)用HE染色觀察大鼠燒傷局部皮膚組織的病理結(jié)構(gòu)，比較UC-MSCs的治療效果。⑵分別收集燒傷后12h、1天、3天、7天的治療組及

2、對(duì)照組大鼠損傷局部的皮膚組織，抽提蛋白，ELISA檢測(cè)治療組及對(duì)照組大鼠皮損內(nèi)TNF-α、IL-1及IFN-γ的表達(dá)；免疫印跡檢測(cè)MCP-1及CCX-2的表達(dá)；免疫組化檢測(cè)皮損中成纖維細(xì)胞及新生血管的數(shù)量。⑶培養(yǎng)骨髓(BM)-MSCs，傳代后分別用含有體積分?jǐn)?shù)為10％正常人血清、燒傷患者血清的低糖達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)基培養(yǎng)，用噻嘩藍(lán)(MTT)法測(cè)定其生長曲線，碘化丙啶(PI)染色，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期、β-半乳糖苷酶(β-gal)染色測(cè)定

3、MSCs的衰老情況。
　　 結(jié)果：①采用貼壁法培養(yǎng)UC-MSCs，細(xì)胞呈成纖維樣的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞之間相互連接，表現(xiàn)為成纖維狀細(xì)胞特有的形態(tài)。分離得到的細(xì)胞其表面標(biāo)記CD105、CD73、CD90表達(dá)陽性率大于95％；CD34、CD45、CD14、CD79、HLA-DR表達(dá)陽性率小于2％。體外誘導(dǎo)分化發(fā)現(xiàn)第7天細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有高折光性的小脂滴出現(xiàn)，主要集中于細(xì)胞核周圍，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長細(xì)胞內(nèi)脂滴逐漸增多，MSCs向脂肪細(xì)胞分化后PP

4、ARγ2、LPL的mRNA表達(dá)陽性。第5天在倒置顯微鏡下可觀察到細(xì)胞形成廣泛均一的鈣化結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)，Runx2/CBFA1、Osteocalcin的mRNA表達(dá)陽性。成年大鼠燒傷后，創(chuàng)面輕度腫脹，創(chuàng)面為黃白色，無水泡形成，活動(dòng)自如，反應(yīng)較敏捷。燒傷后第二天，創(chuàng)面顏色變深，創(chuàng)面出現(xiàn)散在的紅色斑塊，形狀不規(guī)則。第三天時(shí)創(chuàng)面呈現(xiàn)灰白色，并出現(xiàn)痂皮，觸之較硬。統(tǒng)計(jì)各組的愈合時(shí)間，發(fā)現(xiàn)UC-MSCs移植治療組大鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間為22±3.1天，對(duì)照組

5、則為27±3.1天。切痂術(shù)后14天開始，UC-MSCs移植治療組的愈合率(56.3％)與對(duì)照組(47.2％)相比較存在明顯差異，移植治療組大鼠創(chuàng)面的愈合率較對(duì)照組顯著加快。對(duì)大鼠皮膚行HE染色，觀察其變化，發(fā)現(xiàn)：燒傷后表皮與真皮均受損傷，表皮細(xì)胞部分脫落，結(jié)構(gòu)不清，表皮下可見組織水腫，血管擴(kuò)張充血。表皮層與真皮層兩層分界不清，真皮層膠原腫脹，表現(xiàn)為均質(zhì)化，有脫水樣改變。部分皮膚出現(xiàn)汗腺、皮脂腺及毛囊破壞。切痂術(shù)后14天，各組創(chuàng)面均出現(xiàn)肉

6、芽組織，治療組的肉芽組織較為豐富，毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞的數(shù)量顯著增多，并有大量的紅色膠原纖維，排列有序；對(duì)照組的新生肉芽組織增生較少，其毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞數(shù)量較移植治療組顯著減少；切痂術(shù)后21天，各組創(chuàng)面均可見表皮層有較多的壞死細(xì)胞及新生的肉芽組織，毛細(xì)血管數(shù)量增多，膠原含量豐富。其中移植治療組創(chuàng)面中各層次的結(jié)構(gòu)較對(duì)照組清晰，且新生的成纖維細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著增加。切痂術(shù)后28天，移植治療組的皮膚各層結(jié)構(gòu)清晰，有新生的毛細(xì)血管，而對(duì)照

7、組皮膚雖有形成，但是層次模糊，且新生血管中有較多的充血。②分別收集燒傷后12h、1天、3天、7天治療組及對(duì)照組大鼠損傷局部的皮膚組織，抽提蛋白，ELISA檢測(cè)治療組及對(duì)照組大鼠皮損內(nèi)上述細(xì)胞因子的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在損傷大鼠的皮膚組織內(nèi)，隨著損傷時(shí)間的延長，皮損內(nèi)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1逐漸增加，燒傷后3天達(dá)到高峰。而給予UC-MSCs移植治療后，燒傷后7天，治療組內(nèi)上述兩種細(xì)胞因子的表達(dá)顯著下降；同時(shí)我們也檢測(cè)了大鼠燒傷后皮損內(nèi)I

8、FN-γ的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)具有抑制炎癥反應(yīng)作用的IFN-γ在燒傷后3天最低，給予UC-MSCs移植后，治療組中IFN-γ的含量顯著增加；檢測(cè)參與淋巴細(xì)胞浸潤誘導(dǎo)的兩種趨化因子MCP-1及CCX-2的變化，發(fā)現(xiàn)燒傷后7天，受損皮膚中MCP-1及CCX-2的表達(dá)治療組較對(duì)照組顯著降低。UC-MSCs移植后比較對(duì)照組及治療組燒傷7天時(shí)受損皮膚中MCP-1及CCX-2的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)UC-MSCs能抑制上述兩種趨化因子的表達(dá)。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，在UC-

9、MSCs移植治療組中，新生的成纖維細(xì)胞數(shù)量在燒傷切痂后14天時(shí)較對(duì)照組顯著增加；在大鼠燒傷切痂后14天，大量的新生血管開始出現(xiàn)，治療組與對(duì)照組相比，UC-MSCs移植治療能促進(jìn)血管的形成及成纖維細(xì)胞的增殖。③燒傷患者血清組培養(yǎng)MSCs較正常人血清組培養(yǎng)生長速度加快，燒傷患者血清組細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例明顯低于正常人血清組，β-gal染色陽性細(xì)胞數(shù)目顯著低于正常人血清組。
　　 結(jié)論：⑴人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能有效促進(jìn)深度燒傷創(chuàng)面