人臍帶間充質(zhì)干細胞對急性肺損傷模型中的治療作用與機制初探.pdf

1、第一部分人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定
　　目的:建立穩(wěn)定、高效的體外分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞(HUC-MSCs)的方法，為采用HUC-MSCs治療急性肺損傷模型做前期準備。
　　方法:貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)HUC-MSCs。手術(shù)臺取正常足月健康嬰兒臍帶組織，剪去兩端結(jié)扎絲線，無菌條件下D-Hanks緩沖液洗滌殘留血液，剖開臍帶，去除靜脈、動脈、外膜，并將其剪碎至1 mm×1mm大小組織塊，均勻接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，加入

2、完全培養(yǎng)基5ml，倒置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)4h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)培養(yǎng)瓶，24h后添加培養(yǎng)基至12ml。每3d半量換液一次，去除未貼壁組織塊。待細胞80％融合時，用0.25％胰蛋白酶消化，按照2∶1比例進行細胞傳代培養(yǎng)。利用流式細胞儀檢測P3代細胞表面標記物CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90及CD105表達。同時利用成骨、成脂及成軟骨條件培養(yǎng)誘導(dǎo)分化第3代細胞，在7天后分別觀測細胞的成骨、成脂及成軟骨分化能力。成骨誘導(dǎo)第20d后，茜素

3、紅染色鑒定HUC-MSCs成骨分化潛能。成脂誘導(dǎo)15d后，油紅O染色鑒定HUC-MSCs成脂分化能力，成軟骨組織形成后進行阿新藍染色鑒定成軟骨分化能力。
　　結(jié)果:原代培養(yǎng)的細胞約24 h內(nèi)貼壁生長，培養(yǎng)96 h后在倒置顯微鏡下觀察可見臍帶組織碎塊周圍出現(xiàn)三角形和成纖維樣貼壁細胞，培養(yǎng)12d后，細胞融合度達到80-90％，細胞呈成纖維細胞樣漩渦式生長，經(jīng)過連續(xù)傳代10次，細胞變?yōu)樾螒B(tài)更為均一的成纖維樣，細胞形態(tài)無明顯改變、無衰老。

4、流式細胞儀檢測HUC-MSCs細胞表面抗原CD34，CD45，CD73，CD90，CD105，HLA-DR表達率分別是0.19，0.19，99.96，99.10，99.42，0.10，符合HUC-MSCs細胞表面標志物特點。成骨誘導(dǎo):誘導(dǎo)第10d可觀察到細胞上方有懸浮的白色鈣結(jié)節(jié)，第20 d茜素紅染色可見白色鈣結(jié)節(jié)呈鐵銹紅染色。成脂誘導(dǎo):誘導(dǎo)第5d觀察到細胞胞質(zhì)中開始有脂滴形成，第15d油紅O染色可見脂滴紅染。成軟骨誘導(dǎo):細胞團塊在25

5、d左右會變得致密，阿新藍染色后成深藍色。
　　結(jié)論:采用貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞的方法穩(wěn)定、可靠，可以獲得純度較高具有多向分化能力的HUC-MSCs。
　　第二部分急性肺損傷模型的建立以及人臍帶間充質(zhì)干細胞對其治療作用
　　目的:建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷(ALI)模型，觀察HUC-MSCs對ALI模型臨床指標的影響，研究HUC-MSCs對ALI模型的保護作用。
　　方法:將BALB/c小

6、鼠分為PBS+PBS（對照組），PBS+MSCs（干細胞對照組），LPS+PBS（模型組），LPS+MSCs（治療組），每組6只老鼠。10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，在麻醉狀態(tài)下行氣管插管術(shù)，PBS+PBS組、PBS+MSCs組和LPS+PBS組、LPS+MSCs組分別給予30μ l PBS和30μ l LPS(5mg/kg)。1h后PBS+MSCs組和PBS+MSCs組經(jīng)氣管插管給70μ l HUC-MSCs懸液（1×10

7、6/只），PBS+PBS和LPS+PBS組經(jīng)氣管插管給PBS（70μ l/只）。分別在HUC-MSCs給入后第1、3、5d，處死收集肺組織標本，觀察肺組織病理改變并進行炎癥評分，計算肺組織濕/干重比(W/D)。
　　結(jié)果:經(jīng)氣管插管給予LPS構(gòu)建的ALI模型組，與對照組比較，H&E染色結(jié)果表明炎癥浸潤明顯、肺泡間隔增厚、肺出血嚴重及表現(xiàn)肺組織水腫的W/D的增加，表明ALI構(gòu)建模型成功。HUC-MSCs治療ALI模型改善了小鼠死亡率

8、，緩解其缺氧狀態(tài)，肺組織病理學(xué)觀察可見ALI+MSCs組第3，5d處理組肺泡及支氣管周圍炎癥細胞明顯減少、肺泡間隔縮小、肺泡間隙出血明顯減輕。肺組織病理評分評價在HUC-MSCs治療ALI模型第3d對對肺泡阻塞程度、肺泡間隔厚度、肺水腫程度有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:經(jīng)氣管給予LPS可以成功構(gòu)建ALI模型，HUC-MSCs可以減輕ALI小鼠模型肺組織損傷程度，改善水腫對ALI小鼠模型具有保護作用。
　　第三

9、部分人臍帶間充質(zhì)干細胞治療急性肺損傷模型的機制初探
　　目的:探究HUC-MSCs對急性肺損傷模型的免疫調(diào)節(jié)作用，明確HUC-MSCs治療急性肺損傷模型的分子機制。
　　方法:DAPI標記HUC-MSCs，氣管插管給HUC-MSCs后示蹤其在肺組織的分布及轉(zhuǎn)移。將BALB/c小鼠分為PBS+PBS組，PBS+MSCs組，LPS+PBS組，LPS+MSCs組，每組6只老鼠。分別在HUC-MSCs給入后第1、2、3d處死小鼠收集

10、BALF標本。對肺泡灌洗液炎性細胞計數(shù)及分類計數(shù)并測定BALF中總蛋白含量，檢測肺組織中髓過氧化物酶MPO活性。蛋白芯片檢測LPS+PBS組與LPS+MSC組BALF中308種蛋白表達。篩選表達有差異蛋白并用ELISA方法驗證BALF中炎癥因子的表達。
　　結(jié)果:DAPI可以高效率的標記HUC-MSCs，氣管插管5h后HUC-MSCs可在肺組織中均勻分布，24h后逐漸減少。LPS+MSC組與LPS+PBS組相比BALF中細胞總數(shù)降