異丙酚影響脂多糖誘導(dǎo)人單核細(xì)胞作用的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景： 異丙酚(propofol)又名得普利麻，化學(xué)名稱2,6二異丙基苯酚，是一種惰性的酚類衍生物，具有起效快、時(shí)效短、蘇醒迅速、蘇醒后意識(shí)清晰等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于膿毒癥、嚴(yán)重創(chuàng)傷等重危病人及ICU有監(jiān)測(cè)條件下的麻醉和鎮(zhèn)靜。近年有大量研究表明異丙酚可有效抑制創(chuàng)傷、手術(shù)等過(guò)程中的炎癥反應(yīng)，其控制LPS引起的炎癥反應(yīng)作用也越來(lái)越引起關(guān)注。但異丙酚控制LPS引起的炎癥反應(yīng)的保護(hù)機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為大概有以下幾個(gè)方面參與了這一過(guò)程：

2、 1、異丙酚抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生； 2、異丙酚能夠清除氧自由基，具有抗氧化作用； 3、異丙酚能夠抑制一氧化氮(nitricoxide，NO)的產(chǎn)生。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)主要包括四個(gè)方面： (1)蛋白質(zhì)分離技術(shù)； (2)蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)： (3)蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)； (4)生物信息技術(shù)。 研究目的： 1，觀察異丙酚對(duì)LPS誘導(dǎo)THP1細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的變

3、化。 2，研究異丙酚影響LPS刺激THP1細(xì)胞作用的蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化。 研究方法： 1，異丙酚對(duì)LPS誘導(dǎo)THP1細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的變化：將體外培養(yǎng)的THP1細(xì)胞分為對(duì)照組，1μg/mlLPS刺激組，1μg/mlLPS加50μmol/L屏丙酚組，用LiquiChip液相蛋白片系統(tǒng)檢測(cè)三組處理因素作用THP1細(xì)胞12h時(shí)對(duì)分泌粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素1β(I

4、L-1β)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的影響。并用不同濃度的異丙酚(0，12.5，25，50，100μmol/L)同1μg/mlLPS聯(lián)合刺激培養(yǎng)好的THP1細(xì)胞，以未加任何刺激的THP1細(xì)胞為對(duì)照，分析異丙酚對(duì)THP1細(xì)胞分泌IL-6、IL-8、TNF-α影響的劑量效應(yīng)。 2，異丙酚影響LPS刺激THP1細(xì)胞作用的蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化 (1)將體外培養(yǎng)好的

5、THP1細(xì)胞分為空白對(duì)照組，1μg/mlLPS刺激組，1μg/mlLPS加50μmol/L異丙酚組。刺激12h后，1000rpm離心10min，棄上清，將細(xì)胞沉淀置液氮中凍存，供下一步蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳檢測(cè)用。 (2)將上述THP1細(xì)胞進(jìn)行總蛋白質(zhì)提取，雙向電泳(2-DE)，利用UMAXPowerLook1100透射掃描儀獲取圖像，用PDQwest7.1.0軟件包進(jìn)行圖像分析，分析包括蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)、量化、背景去除和點(diǎn)的匹配，

6、找出三組圖譜中的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。 (3)將差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶切與MALDI-TOF質(zhì)譜分析。 (4)對(duì)所得的肽質(zhì)量指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)分析，明確蛋白質(zhì)的類型及性質(zhì)。 (5)應(yīng)用WesternBlot對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出的部分蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。 (6)查詢文獻(xiàn)分析篩選獲得的差異表達(dá)蛋白質(zhì)功能，結(jié)合上述與這些蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)的分析，選擇功能上具有聯(lián)系的蛋白質(zhì)，運(yùn)用String數(shù)據(jù)庫(kù)及其軟件進(jìn)行相互作用分析，預(yù)測(cè)是否

7、有蛋白質(zhì)作用對(duì)存在。 結(jié)果： 1，異丙酚對(duì)LPS誘導(dǎo)THP1細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的影響 (1)LPS誘導(dǎo)THP1細(xì)胞釋放細(xì)胞因子以及異丙酚對(duì)其的影響：與對(duì)照組相比，LPS組IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α明顯增高(P<0.01)；而GM-CSF、IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-1β、IL-2、IL-4的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與LPS組相比，LPS加50μmol/L異丙酚組THP1細(xì)胞

8、釋放IL-6、IL-8和TNF-α明顯降低(均P<0.01)。 (2)異丙酚對(duì)LPS誘導(dǎo)THP1細(xì)胞釋放IL-6、IL-8和TNF-α的量效關(guān)系：結(jié)果發(fā)現(xiàn)異丙酚濃度為12.5μmol/L時(shí)就顯示出對(duì)LPS誘導(dǎo)IL-6、IL-8和TNF-α釋放的抑制效應(yīng)，分別從刺激后的266±78pg/ml、1552±279pg/ml、1787±388pg/ml減少到201±67pg/ml(P<0.01)、1364±157pg/ml(P<0.05

9、)、1203±265pg/ml(P<0.01)，隨著異丙酚劑量的增加，三者的釋放進(jìn)一步顯著減少，至異丙酚濃度為100μmol/L時(shí)三種細(xì)胞因子的濃度分別是34±12pg/ml、627±135pg/ml、203±72pg/ml，已基本接近正常對(duì)照組水平(P>0.05)。將異丙酚濃度與IL-6、IL-8、TNF-α值做Linearity線性趨勢(shì)分析顯示其F及P值分別為(129.61，0.00)、(163.01，0.00)和(259.96，0

10、.00)，說(shuō)明隨著異丙酚劑量的增加，三者的釋放呈遞減趨勢(shì)。 2，異丙酚影響LPS刺激THP1細(xì)胞作用的蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化 (1)三組雙向凝膠電泳圖像清晰，沒(méi)有背景條紋的干擾，蛋白質(zhì)斑點(diǎn)分離完全，在相同條件下，反復(fù)3次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖大致相同，三組圖譜圖象分析后平均檢測(cè)到101016個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。選取對(duì)照組圖譜作為參考膠，其它兩組膠與參考膠匹配，使各凝膠中的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)與參考膠中的對(duì)應(yīng)起來(lái)，與參考膠中同一蛋白質(zhì)斑點(diǎn)相匹配的點(diǎn)

11、為同一種蛋白質(zhì)。匹配結(jié)果顯示三組膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)匹配百分率約為79.84％。 (2)選擇9個(gè)在三組中出現(xiàn)較大變化趨勢(shì)的蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，獲得有效鑒定的四種蛋白質(zhì)分別為Stathmin1、ubiquitin-conjugatingenzymeE2N、ChainA，1113tMutantOfHumanSod1和programmedcelldeath6。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)其中Stathmin1與programmedcelldeath6功

12、能上相關(guān)，生物信息學(xué)分析也提示二者存在間接的相互作用。 結(jié)論： 1，LPS可誘導(dǎo)THP1細(xì)胞多種細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α，異丙酚可以劑量依賴的方式抑制IL-6、IL-8和TNF-α的釋放，這可能是其在內(nèi)毒素血癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮保護(hù)作用的分子機(jī)制之一。 2，建立了重復(fù)和穩(wěn)定性較好的單核細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取方法和2-DE方法，并對(duì)通過(guò)質(zhì)譜鑒定出的2個(gè)差異表達(dá)蛋白用western-blot技術(shù)

13、進(jìn)行了更進(jìn)一步的驗(yàn)證，與2-DE結(jié)果完全一致，從而證明了2-DE結(jié)果的可靠性。 3，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究獲得有效鑒定的蛋白質(zhì)中有三種蛋白Stathmin1、ubiquitin-conjugatingenzymeE2N、ChainA，1113tMutantOfHumanSod1在LPS刺激THP1細(xì)胞后表達(dá)上調(diào)，而同時(shí)給予異丙酚處理后下調(diào)，另外一種蛋白質(zhì)programmedcelldeath6正好與上述趨勢(shì)相反。 說(shuō)明這四種

14、蛋白質(zhì)在異丙酚抗LPS引起的炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)Stathmin1與programmedcelldeath6功能上相關(guān)，生物信息學(xué)分析提示二者存在間接的相互作用。上述結(jié)果提示我們這四種蛋白質(zhì)可能在以下方面產(chǎn)生影響。 (1)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定：在內(nèi)毒素休克過(guò)程中，由于呼吸爆發(fā)的產(chǎn)生，大量的氧自由基產(chǎn)生，對(duì)組織和細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，因此對(duì)抗超氧化的物質(zhì)也增多，如SOD1。為了抵抗氧自由基的損傷作用，SOD1表

15、達(dá)增加，以清除過(guò)多生成的氧自由基。當(dāng)給予異丙酚處理后，由于異丙酚能夠抑制細(xì)胞中的活性氧產(chǎn)生，于是能夠有效抵抗LPS通過(guò)產(chǎn)生氧自由基而引起的細(xì)胞損傷作用。當(dāng)異丙酚的清除氧自由基作用發(fā)揮效力時(shí)，活性氧產(chǎn)生不異常增加，不會(huì)誘導(dǎo)SOD1表達(dá)上調(diào)。LPS刺激THP1細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)環(huán)境會(huì)處于不穩(wěn)定狀態(tài)，ubiquitin-coniugatingenzymeE2N上調(diào)表明由于LPS刺激，細(xì)胞對(duì)短壽蛋白的降解清除活躍，這樣就可能破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而在

16、LPS刺激同時(shí)給予異丙酚處理后，ubiquitin-conjugatingenzymeE2N有恢復(fù)趨勢(shì)，表明細(xì)胞對(duì)短壽蛋白的降解清除受到了抑制，因此細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境趨向于向穩(wěn)定的方向，有助于細(xì)胞行使其正常功能。 (2)恢復(fù)單核細(xì)胞的凋亡障礙：在生長(zhǎng)發(fā)育、組織細(xì)胞增殖過(guò)程中，分化和細(xì)胞死亡是處于平衡之中的，并且受到一系列調(diào)控因子的影響。這種平衡的打破通常意味著各種疾病的發(fā)生。LPS刺激單核細(xì)胞能夠使細(xì)胞stathmin1上調(diào)而使pro

17、grammedcelldeath6下調(diào)，出現(xiàn)凋亡障礙的情況，而這種凋亡障礙是全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflamatoryresponsesyndrome，SIRS)和多器官功能障礙綜合征的重要原因，而異丙酚能夠通過(guò)下調(diào)stathminl同時(shí)上調(diào)programmedcelldeath6抑制LPS刺激引起的這種凋亡障礙，從而發(fā)揮其抗LPS損傷作用。生物信息學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白質(zhì)存在間接相互作用也為這一點(diǎn)提供了有力的支持。