低氧通過CD9調(diào)控創(chuàng)面修復(fù)主要效應(yīng)細(xì)胞移行與增殖的研究.pdf

1、創(chuàng)面愈合是十分復(fù)雜的過程,其中最為重要的是角質(zhì)細(xì)胞的遷移和成纖維細(xì)胞的移行,在愈合的過程中,角質(zhì)細(xì)胞通過松脫細(xì)胞與細(xì)胞,細(xì)胞與基質(zhì)之間的橋粒與半橋粒的連接,還有改變細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白等來配合細(xì)胞向創(chuàng)面中心移行。而這過程受生長(zhǎng)因子,細(xì)胞因子,趨化因子,抗菌肽,氧分壓以及金屬蛋白酶基質(zhì)等諸多因素的影響。大量實(shí)驗(yàn)證明創(chuàng)面形成后,因?yàn)閯?chuàng)面局部耗氧量增加以及血管網(wǎng)遭破壞,而導(dǎo)致創(chuàng)面局部形成低氧環(huán)境。創(chuàng)面低氧也成為創(chuàng)面形成后普遍存在的現(xiàn)象,因此聚焦了大量

2、低氧環(huán)境對(duì)創(chuàng)面愈合的研究。低氧在創(chuàng)面愈合中不僅僅影響細(xì)胞代謝,低氧環(huán)境還可以調(diào)控生長(zhǎng)因子的生成,促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖以及加快表皮細(xì)胞的移行。但是其具體分子機(jī)制不是十分明確。
　　MMPs是一組能夠水解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白裂解酶,MMP-9是其家族中的重要一員,又稱Ⅳ型膠原酶或明膠酶。MMP-9合成后以酶原的形式從胞內(nèi)分泌到胞外。MMP-9參與了急性創(chuàng)面修復(fù)的一些早期步驟,包括角質(zhì)形成細(xì)胞從基底膜脫離,促進(jìn)細(xì)胞沿創(chuàng)面基質(zhì)爬行等。MMP-

3、9表達(dá)升高可促進(jìn)上皮細(xì)胞的移行;反之,則抑制表皮細(xì)胞移行。低氧環(huán)境可以促進(jìn)MMP-9的表達(dá),而其中低氧因素對(duì)表皮細(xì)胞表達(dá)MMP-9有促進(jìn)作用,而對(duì)成纖維細(xì)胞無明顯作用。
　　CD9是一種24kDa的細(xì)胞表面四次跨膜蛋白,該蛋白在血小板活化與凝聚,精卵融合,細(xì)胞移行和增殖等多方面均發(fā)揮作用。其中機(jī)制目前不完全清楚,我組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面形成后角質(zhì)形成細(xì)胞CD9表達(dá)下降,可能與細(xì)胞移行有關(guān)。通過研究發(fā)現(xiàn)體外實(shí)驗(yàn)中,單純低氧因素可以降低表

4、皮細(xì)胞CD9的表達(dá),卻使得成纖維細(xì)胞CD9表達(dá)升高。以往有研究發(fā)現(xiàn)在卵細(xì)胞中CD9可通過整合素β1提高細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性。但是,目前仍然沒有基礎(chǔ)研究創(chuàng)面中低氧如何通過調(diào)節(jié)CD9參與創(chuàng)面愈合的過程。
　　在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)在低氧條件下,HaCaT細(xì)胞CD9表達(dá)下調(diào),但是低氧未明顯促進(jìn)細(xì)胞移行,而在成纖維細(xì)胞中CD9表達(dá)升高,可促進(jìn)其增殖,并在創(chuàng)面愈合過程中具有積極作用。
　　1.材料與方法：
　　采用體外實(shí)驗(yàn)的方法。
　

5、　比較常氧及低氧條件下表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞移行及增殖的變化,遵循既有方法,原代培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞,應(yīng)用表皮細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞株。給予兩種細(xì)胞2％氧氣培養(yǎng)環(huán)境,應(yīng)用transwell及細(xì)胞劃痕觀察細(xì)胞移行,CCK-8及Brdu標(biāo)記法測(cè)定細(xì)胞增殖,于2%氧氣下培育24h后觀察兩種細(xì)胞的移行既增殖變化。以觀察低氧環(huán)境其對(duì)創(chuàng)面修復(fù)主要細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。
　　給予表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞2%氧氣(93%N2,5%CO2,2%O2)作用12h,1

6、8h和24h后,檢測(cè)缺氧條件下,以Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CD9,MMP-9,p-AKT和p38蛋白表達(dá)量,同時(shí)應(yīng)用明膠酶譜測(cè)兩種細(xì)胞在低氧環(huán)境下胞外分泌MMP-9的。應(yīng)用realtime PCR檢測(cè)低氧下HaCaT細(xì)胞MMP-9mRNA的表達(dá)。
　　2.主要結(jié)果與結(jié)論：
　　2.1.應(yīng)用Western blot檢測(cè)MMP-9蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)低氧3h組與低氧6h組中HaCaT細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)水平比常氧對(duì)照組顯著增

7、加。而在成纖維細(xì)胞中,無論是常氧或是低氧培養(yǎng)條件,幾乎未檢測(cè)到MMP-9表達(dá)。
　　2.2.而在明膠酶譜法檢測(cè)MMP-9的胞外分泌也發(fā)現(xiàn)HaCaT表皮細(xì)胞低氧6h組比常氧對(duì)照組顯著差異(P=0.001)。而成纖維細(xì)胞無論常氧還是在低氧培養(yǎng)下,其培養(yǎng)液中胞外分泌的MP-9的含量都極少。
　　2.3.應(yīng)用Realtime PCR檢測(cè)MMP-9mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)低氧培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞6h后,HaCaT細(xì)胞MMP-9mRNA水平較常氧

8、對(duì)照組明顯增高。提示低氧環(huán)境從翻譯水平上調(diào)控表皮細(xì)胞MMP-9的表達(dá)。
　　2.4.應(yīng)用2%氧含量模擬創(chuàng)面缺氧環(huán)境,對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行低氧培養(yǎng),應(yīng)用CCK-8及Brdu增殖細(xì)胞免疫染色檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低氧組(H)較常氧對(duì)照組(Con)增殖快(P<0.05)。
　　2.5.我們?cè)诘脱醐h(huán)境下培養(yǎng)表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞,分12h、18h及24h觀察CD9蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示成纖維細(xì)胞缺氧組(H)較常氧對(duì)照組(Con

9、)CD9蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)。而表皮細(xì)胞缺氧組(H)較常氧對(duì)照組(Con)CD9蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。
　　2.6.我們應(yīng)用高表達(dá)CD9腺病毒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞72h后,應(yīng)用western blot檢測(cè)細(xì)胞CD9的表達(dá),發(fā)現(xiàn)55kd(即CD9與GFP融合蛋白)處高表達(dá)轉(zhuǎn)染組較空載組表達(dá)增加,而25kd處無明顯變化,說明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成功。同時(shí)應(yīng)用CCK8的方法檢測(cè)成纖維細(xì)胞的增殖,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD9高表達(dá)組較空載