Mtsarg1-β的分子克隆和特征分析多囊腎PKD1基因的突變檢測.pdf

1、人類大多數(shù)疾病的發(fā)生與患者的基因變異有關,而發(fā)現(xiàn)這些基因變異對疾病的診斷、預防和治療都具有重要意義。遺傳病分為基因病和染色體病兩大類,臨床遺傳學是研究遺傳病的診斷和預防的科學。本論文從臨床遺傳學的研究方向出發(fā),從分子遺傳學的水平探討男性不育精子發(fā)生相關的基因和常染色體顯性多囊腎病的遺傳基礎。男性不育有相當部分與睪丸的精子發(fā)生相關,而精子發(fā)生受到許多基因的調控,
　　本研究在第一部分,克隆了Mtsarg1-β—Mtsarg1(又稱為

2、Spata3,Spermatogenesis associated 3,精子發(fā)生相關3)基因的一個新的轉錄本,并對Mtsarg1-β和Mtsarg1進行了特征分析。在第二部分,根據(jù)我室遺傳咨詢門診常有多囊腎患者就診,需進行生育前的遺傳學診斷,首次在本室應用PCR-DHPLC或SSCP、DNA測序方法進行了多囊腎患者多囊腎病Ⅰ型基因(PKD1基因)的突變檢測,在多囊腎患者中發(fā)現(xiàn)了一個新的無義突變、一個錯義突變及一個多態(tài),在正常人對照中發(fā)現(xiàn)

3、了兩種新的多態(tài)。第一部分:Mtsarg1-β的分子克隆和特征分析遺傳因素在男性生精過程中起重要作用,據(jù)估計,由于遺傳缺陷包括基因突變和染色體異常所引起的精子發(fā)生障礙約占男性不育的30％以上,有相當部分的男性不育有不能確認的遺傳變異存在。睪丸生精細胞的增殖、分化受多種因素調控,而生精細胞內基因水平的調節(jié),在精子發(fā)生過程中起著決定性作用。精子產(chǎn)生與睪丸的生殖細胞凋亡相伴隨,后者同樣受到許多基因的調節(jié)。發(fā)現(xiàn)新的與睪丸精子產(chǎn)生或生殖細胞凋亡相關

4、的基因對于深入理解睪丸精子產(chǎn)生的生理和病理機制,對于預防、診斷和治療男性不育和睪丸腫瘤都具有重要意義。
　　本研究室姜宏等通過建立小鼠睪丸凋亡模型,運用抑制消減雜交法克隆出24個小鼠睪丸生精細胞凋亡相關基因的ESTs(expressedsequence tags,ESTs,表達序列標簽)。傅俊江等從上述的EST(BE644538)出發(fā),運用生物信息學和實驗技術,克隆了全長1103bp的Mtsarg1基因(Mus musculus

5、testis and spermatogenesis cellapoptosis-related gene 1,GenBank接受號:AF399971,2002年;再命名為Spata3,Mus musculus spermatogenesis associated 3,2004)。目前,我們通過逆轉錄-聚合酶鏈反應(reversetranscription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、T—A克隆以

6、及測序克隆了一個長887bp的Mtsarg 1的新的轉錄本,命名為Mtsarg1-β(GenBank接受號為EU259321和EF546784,2007年,命名為Spata3,variant 4),并分析了Mtsarg1-β和Mtsarg1的特征。Mtsarg1-β與Mtsarg1具有高度相似性,Mtsarg1-β包含一個417bp的完整開放閱讀框,編碼138個氨基酸組成的蛋白質。Mtsarg1-β蛋白是一個理論分子量14.79kD、等

7、電點9.74的非分泌性蛋白,其N-端的100個氨基酸與Mtsarg1一致,其后的38個氨基酸不同于Mtsarg1。成年的DBA/2小鼠的多組織RT-PCR和Northern blot分析顯示Mtsarg1-β和Mtsarg1的mRNA在睪丸中特異性的高表達;RT-PCR結果也表明Mtsarg1-β和Mtsarg1在小鼠GC-1精原細胞中無表達;原位雜交顯示Mtsarg1和可能Mtsarg1-β主要表達在小鼠睪丸的精母細胞中;亞細胞定位分

8、析揭示Mtsarg1蛋白主要定位在細胞核,而Mtsarg1-β蛋白主要定位在細胞漿中。利用原核表達系統(tǒng)pET21-a(+)對Mtsarg1編碼的產(chǎn)物進行了原核表達。上述這些結果表明Mtsarg1和Mtsarg1-β在小鼠睪丸的功能和精母細胞的發(fā)育中可能起重要作用。由于時間的限制,這只是一個初步的研究,今后將對Mtsarg1和Mtsarg1-β的功能進行深入研究。
　　第二部分:多囊腎PKD1基因的突變檢測
　　目的：對多囊腎

9、患者進行基因診斷,檢測常染色體顯性多囊腎常見的致病基因-多囊腎?、裥突?PKD1)的基因突變,以發(fā)現(xiàn)多囊腎患者的致病原因。
　　方法對12例多囊腎患者及相關親屬進行了PKD1基因的突變檢測。針對PKD1的3’端單拷貝區(qū)的12個外顯子(35-46號外顯子)序列采用相應的引物,以患者基因組DNA為模板進行聚合酶鏈反應(polymerasechain reaction,PCR)擴增。應用變性高效液相色譜(Denaturinghigh-

10、performance liquid chromatography,DHPLC)或單鏈構象多態(tài)性(Single strand conformation polymorphism,SSCP)技術對PKD1基因外顯子PCR產(chǎn)物進行突變檢測。隨后,對有異常峰形的PCR產(chǎn)物進行了測序。
　　結果：經(jīng)PCR-DHPLC、DNA測序分析,在7例患者中,發(fā)現(xiàn)3例患者存在PKD1基因的突變,其中在患者1發(fā)現(xiàn)一個新的無義突變,為PKD1的42外顯子

11、的C11901A,導致原絲氨酸3897變?yōu)榻K止密碼子。在患者2發(fā)現(xiàn)一個錯義突變,為35外顯子的C10737T,導致原蘇氨酸3509變?yōu)榧琢虬彼?此錯義突變以前在PKD患者中曾有報道,為致病突變。在患者3發(fā)現(xiàn)一個同義突變?yōu)?9外顯子的G11470C。在正常人對照中發(fā)現(xiàn)兩種同義突變分別為42外顯子的G11824A及C11860T。其它5例用PCR-SSCP、DNA測序方法檢測的患者均未發(fā)現(xiàn)異常。
　　結論：成功地用PCR-DHPLC或