白三烯B4炎性通路中EMMPRIN基因沉默對(duì)NF-kB的影響.pdf

1、研究背景:
　　冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease)是以動(dòng)脈粥樣硬化為基礎(chǔ)發(fā)展而來(lái)的疾病，疾病的進(jìn)展可導(dǎo)致急性冠脈綜合癥(Acutecoronary syndrome)的發(fā)生。斑塊的易損性是受炎癥細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(Matrixmetalloproteinase MMPS)分解斑塊外面的纖維帽引起的。細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（Extracellular matr

2、ix metalloproteinase inducer EMMPRIN）它的上調(diào)能增加MMPs的表達(dá)水平，而NF-κB(nuclear factor-kappa B)作為一種轉(zhuǎn)錄因子，它和EMMPRIN在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中有著密切的聯(lián)系，但它們的關(guān)系目前尚未完全明確。
　　目的:
　　研究位于細(xì)胞膜表面的EMMPRIN及核因子κB之間的關(guān)系。探討在急性心肌梗死發(fā)生后，通過(guò)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)患者血清中MMP-9及LTB4的水平及

3、其隨時(shí)間的變化情況。
　　方法:
　　1細(xì)胞 THP-1細(xì)胞株采用含10％胎牛血清的RPMI-1640于37℃、5％ CO2恒溫孵育箱傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106cell/L，傳代進(jìn)行試驗(yàn)。THP-1源性巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo):在生長(zhǎng)良好的細(xì)胞株中加入PMA（終濃度160 nmol/L），在上述條件下孵育24小時(shí)后，懸浮生長(zhǎng)的單核細(xì)胞向貼壁生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞分化。THP-1源性泡沫細(xì)胞的誘導(dǎo):PMA誘導(dǎo)THP-1單核細(xì)胞分

4、化成巨噬細(xì)胞24h后，無(wú)血清RPMI-1640洗滌三次，換含LTB4（終濃度為1×10-7）的無(wú)血清RPMI-1640繼續(xù)培養(yǎng)24h，誘導(dǎo)成泡沫細(xì)胞，油紅O染色對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)進(jìn)行鑒定。
　　2 Thp-1源性巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染濃度梯度摸索取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Thp-1源性巨噬細(xì)胞接種于24孔板1-10孔，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×1051cell/well，使轉(zhuǎn)染前細(xì)胞的匯合度達(dá)到90％。分別用Opti-MEM稀釋紅色熒光對(duì)照(Re

5、d Flourescent Control)和lipofectamine RNAiMAX reagent后（1-10孔中siRNA的濃度從10nmol/L-100nmol/L遞增），按1∶1混合，靜置5分鐘，于1-10孔中每孔加入轉(zhuǎn)染試劑50ul，將細(xì)胞置于37℃、5％ CO2恒溫孵育箱孵育24小時(shí)，24小時(shí)后熒光倒置顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，選取細(xì)胞內(nèi)熒光最多即轉(zhuǎn)染效率最高的濃度作為轉(zhuǎn)染濃度。
　　3轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)根據(jù)Invitrogen公

6、司網(wǎng)站軟件設(shè)計(jì)合成3對(duì)沉默EMMPRIN基因的siRNA干擾序列，siRNA1:正義鏈5'-CACCCACCGCCACAAUAAATT-3'，反義鏈5'-UUUAUUGUGGCGGUGGGUGGG-3'。 SiRNA2:正義鏈5'-GGAUUCCGUUCCUUAGGUUTT-3'，反義鏈5'-AACCUAAGGAACAGAAUCCTG-3'。并合成對(duì)照siRNA:正義鏈5'-AGCGUUCACACCCAACCUGTT-3'，反義鏈5'-

7、CAGGUUGGGUGUGAACGCUTT-3'。實(shí)驗(yàn)分為六組:具體見(jiàn)如下實(shí)驗(yàn)，分別接種于新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。摸索實(shí)驗(yàn)的最佳濃度，24小時(shí)后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，siRNA終濃度見(jiàn)如下實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染后進(jìn)一步誘導(dǎo)成泡沫細(xì)胞形成，37℃培養(yǎng)箱孵育24小時(shí)提取蛋白進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　4 NF-κB通道阻滯實(shí)驗(yàn)分四組:對(duì)照組、泡沫細(xì)胞組、藥物干預(yù)組1、藥物干預(yù)組2。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Thp-1細(xì)胞分別接種于25cm2培養(yǎng)瓶，5ml培養(yǎng)基，PMA誘導(dǎo)成巨噬

8、細(xì)胞24小時(shí)后，給藥組加入Bay-117082于37℃、5％CO2、飽和濕度下孵育2小時(shí)，再以LTB4孵育24小時(shí)誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成。
　　5 MTS比色法測(cè)定NF-κ B阻滯劑Bay-117082不同濃度的細(xì)胞毒性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)好的Thp-1源性巨噬細(xì)胞接種于96孔板，每孔100ul培養(yǎng)基，給予不同濃度Bay-117082，每孔加入20ulMTS液，恒溫箱3.5小時(shí)，測(cè)定各孔吸光值。
　　6 RT-PCR檢測(cè)NF-κ

9、B通道阻滯后細(xì)胞CD147表達(dá)接種于6孔板，按上述方法分組，每組6孔，2ml培養(yǎng)基/孔，PBS洗三遍，利用Trizol提取細(xì)胞總RNA。Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞CD147mRNA水平，B-actin為內(nèi)參照。CD147引物序列如下:正義鏈:5'-cctcacagggcaccgctggct-3'，反義鏈5'-cggcctccatgttcaggttctcaa-3'。 B-actin引物序列如下:5'-aagatgacccagatc

10、atgtttga-3'，反義鏈5'-ttaatgtcacccacgatttcc-3'
　　7 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染和NF-κB通道阻滯后細(xì)胞蛋白表達(dá)水平接種于培養(yǎng)瓶上，按上述方法轉(zhuǎn)染及以阻斷NF-κB后，利用蛋白裂解液于冰上裂解細(xì)胞收集蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移槽恒壓半干轉(zhuǎn)30min將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉過(guò)夜，P65兔抗一抗室溫孵育2小時(shí)(1∶1000PBST稀釋)、CD147兔抗一抗室溫

11、孵育2小時(shí)（1∶2000 PBST稀釋?zhuān)-actin兔抗一抗室溫孵育2小時(shí)（1∶1000 PBST稀釋?zhuān)琍BST洗膜，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗兔二抗于室溫下孵育，PBST洗膜后ECL發(fā)光顯色試劑盒進(jìn)行顯影，檢測(cè)曝光強(qiáng)度，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。
　　8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，所有結(jié)果用(x)(□)s表示，兩組間差異顯著性的檢驗(yàn)采用q檢驗(yàn)，多組間采用方差分析。
　　結(jié)果:
　　1.THP-1細(xì)胞中加入PMA

12、(160nmol/L)誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，然后EMMPRIN-siRNA通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成，通過(guò)對(duì)蛋白的印跡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞中NF-κB的蛋白表達(dá)和對(duì)照組相比顯著減少(P＜0.05)。
　　2.THP-1細(xì)胞中加入PMA(160nmol/L)誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，藥物Bay-117082干預(yù)給藥，抑制NF-κ B表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成，通過(guò)Westernblotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EMMPRIN的基因

13、和蛋白表達(dá)較對(duì)照組相比顯著減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LTB4在冠心病的發(fā)展中能促使EMMPRIN表達(dá)的上調(diào)。NF-κ B與冠心病的炎性通路密切相關(guān)，而TLB4是否通過(guò)EMMPRIN通路上調(diào)NF-κB的表達(dá)我們還尚不可知，在本實(shí)驗(yàn)中我們證實(shí)通過(guò)下調(diào)EMMPRIN基因，NF-κ B表達(dá)下降，而抑制NF-κB通道EMMPRIN的表達(dá)也下降，從而說(shuō)明EMMPRIN與NF-κB存在某些聯(lián)系，而LTB