轉錄因子NF-kB信號通路在胰島炎發(fā)生中的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 胰腺炎是胰腺的一種炎癥性疾病導致高發(fā)病率和死亡率。目前主要以對癥治療為主。由于缺乏對于細胞病理生理早期重要事件發(fā)生的認識和理解，特異而又有效的預防手段及治療目前還很貧乏。在胰腺胰腺炎中轉錄因子NF-kB被激活，促進多種促炎基因的轉錄?；罨腘F-kB誘導多種炎癥和凋亡反應的基因轉錄。NF-kB炎癥靶基因包括細胞因子，趨化因子，免疫受體和粘附分子。NF-kB凋亡相關靶基因包括一些抗凋亡分子家族，例如BCL-X，c

2、IAPs。在一些更復雜的系統(tǒng)中，NF-kB發(fā)揮促進凋亡的作用，NF-kB活性也能通過上調抑制IkB-a誘導自身負反饋。細胞內NF-kB是復雜的同時又處于一種平衡狀態(tài)。
　　 文獻報道關于胰腺炎機制存在很多爭議，大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)NF-kB是胰腺炎發(fā)生中的關鍵因素，藥物抑制NF-kB活性可以改善胰腺炎的疾病進展，然而沒有一種抑制劑能夠絕對特異利用，這些結論尚不能作為最終定論。另有研究顯示在雨蛙素誘導的胰腺炎中，藥物抑制NF-kB延長并

3、加重急性胰腺炎，同時有人報道IKK轉基因沒有誘導胰腺損傷，從這些研究提示NF-kB主要功能不是促進胰腺炎而是一個保護因素，這些相互矛盾結果顯示，NF-kB在胰腺炎發(fā)生中存在很大的爭議。
　　 研究目標：
　　 1.建立和利用胰腺特異性NF-kB轉基因和基因敲出小鼠，構建胰腺炎模型，模擬疾病過程。
　　 2.觀察胰腺炎發(fā)生過程中，NF-kB基因鼠的表型并初步探討NF-kB調控胰腺炎過程的機制。
　　 3.深

4、入研究NF-kB參與胰腺炎發(fā)生過程的信號通路及潛在治療靶點。
　　 研究方法：
　　 圍繞上述目標，本研究采用以下研究方法：
　　 1.質粒構建
　　 p65/CreER質粒的構建p65編碼全長cDNA利用XhoⅠ/XbaⅠ從pBluescriptSK+質粒中切下，連接到Loxp-EGFP-Loxp片段后，克隆到含EcoRⅠ位點的pCAGGS載體，pCAGGS載體含有CMV啟動子和一個Chickenbet

5、aactin外顯子。用SpeⅠ/HindⅢ雙酶切切下CMV-Loxp-EGFP-Loxp-p65序列，原核注射去繁殖p65F/F小鼠
　　 2.動物模型的建立
　　 2.1p65/CreER胰腺腺泡特異性轉基因小鼠胰腺炎模型的建立
　　 2.2p65/IKK/CreER胰腺腺泡特異性轉基因小鼠胰腺炎模型的建立
　　 2.3IKK-KO胰腺腺泡特異性小鼠胰腺炎模型的建立雨蛙素50ug/kg腹腔注射或左旋精氨

6、酸4g/kg腹腔注射構建小鼠急性胰腺炎模型
　　 3.免疫組化
　　 經(jīng)漂洗，封閉，一抗和二抗孵育后檢測pSTAT3、pERK、F4/80、Caspase3、CD45、Ki-67、p65等因子在胰腺組織中的表達。
　　 4.RT-PCR
　　 通過RNA提取、逆轉錄和RT-PCR的方法對胰腺組織，IL-1b、TGF-b、Fibronectin、a-SMA、IL-6、TNF-a、RPS6等的mRNA表達水平

7、進行檢測。
　　 5.EMSA
　　 將NF-kB探針與細胞核蛋白混合，用抗體標記后進行凝膠電泳，觀察探針與蛋白的結合能力。
　　 6.WesternBlot
　　 經(jīng)過提取蛋白、凝膠電泳、轉膜、標記一抗和二抗、曝光等步驟觀察a-SMA、Amylase、pSTAT3、BCL2、LC3、Beclin1、ATG7、ATG12、GAPDH等因子的蛋白表達。
　　 7.統(tǒng)計學分析
　　 所有數(shù)據(jù)均

8、采用x±S表示，計量資料分析采用t檢驗；計數(shù)資料分析采用x2檢驗，小樣本資料采用Fisher’sExactTest。P<0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　 研究結果：
　　 1.胰腺腺泡細胞p65轉基因沒有明顯代償性改變及表型誘導劑他莫西芬誘導后，和對照組比較病理沒有明顯改變。EMSA結果顯示，NF-kB活性沒有增加。
　　 2.p65轉基因增加雨蛙素誘導NF-kB活性及加重急性胰腺炎程度，長期大劑量雨蛙素注射，誘導

9、慢性胰腺炎的發(fā)生
　　 通過EMSA發(fā)現(xiàn)，對照組、p65/CreER組NF-kB活性沒有增加，對照雨蛙素組和p65/CreER雨蛙素組NF-kB活性均增加，p65/CreER組更為顯著。雨蛙素急性胰腺炎模型中，p65/CreER胰腺炎更嚴重，血清淀粉酶水平更高，水腫更明顯。長期雨蛙素刺激，p65/CreER組腺泡萎縮，炎細胞浸潤和纖維化，提示慢性胰腺炎發(fā)生。
　　 3.IKK2轉基因自發(fā)誘導胰腺炎
　　 給予誘導

10、劑他莫西芬，IKK2轉基因鼠發(fā)生p65核定位改變，表達從胞漿至核內。給予誘導劑7天，IKK2轉基因數(shù)有自發(fā)胰腺炎，腺泡細胞損傷，水腫，炎細胞浸潤，誘導后90天觀察，小鼠體重減輕，病理有慢性胰腺炎的改變。
　　 4.p65/IKK2轉基因誘導重癥胰腺炎及自噬增加
　　 給予誘導劑P65/IKK2后，小鼠腺泡損傷嚴重，細胞因子纖維化因子mRNA水平表達明顯升高。蛋白質水平檢測自噬相關因子，表達升高。提示通過增加活化NF-kB

11、水平使得自噬水平升高。
　　 5.抑制自噬，雨蛙素誘導p65/IKK2轉基因小鼠胰腺炎加重
　　 給予自噬抑制劑氯喹，病理顯示p65/IKK2轉基因小鼠胰腺損傷更明顯。a-SMA蛋白水平升高，提示激活星狀細胞。Amylase蛋白水平降低，提示胰腺腺泡損傷更為劇烈。
　　 6.IKK2-KO在不同胰腺炎模型中胰腺炎加重
　　 IKK2-KO在雨蛙素誘導急性胰腺炎模型、左旋精氨酸誘導急性胰腺炎模型中病理提示均

12、比對照組胰腺炎更重。左旋精氨酸模型誘導模型類似壞死性胰腺炎。
　　 7.pSTAT3介導BCL-2參與IKK2-KO誘導急性胰腺炎
　　 雨蛙素1H后，Western-blot檢測pSTAT3明顯升高，免疫熒光檢測p65核定位發(fā)現(xiàn)：IKK2-KO入核少，大多數(shù)在胞漿表達，對照組表達在核內。檢測STAT3下游靶基因BCL-2發(fā)現(xiàn)，蛋白水平升高。
　　 8.抑制STAT3對于IKK2-KO小鼠急性胰腺炎的影響。

13、>　　 使用STAT3抑制劑S3I-201組，病理顯示均能明顯降低急性胰腺炎嚴重程度，炎細胞浸潤減少，水腫減輕。
　　 結論
　　 1.NF-kB在胰腺炎發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。
　　 2.NF-kB激活能加重急性胰腺炎、誘導慢性胰腺炎。抑制NF-kB活性將有利于胰腺炎預防和治療。
　　 3.自噬在NF-kB激活狀態(tài)下起保護作用。
　　 4.pSTAT3參與激活Bcl-2機制使得IKK2-KO小