白三烯B-,4-—白三烯B-,4-受體通路在川崎病發(fā)病機(jī)制及治療中的意義.pdf

1、目的：觀察川崎病急性血清和丙種球蛋白對血管內(nèi)皮細(xì)胞白三烯B4受體1(BLT1，leukotrieneB4receptor1)基因的表達(dá)及內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生白三烯B4(LTB4，leukotrieneB4)的影響，并觀察不同刺激后的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)白三烯B4受體2(BLT2，leukotrieneB4receptor2)的影響，以了解LTB4-BLT通路在川崎病血管損傷過程中的作用以及丙種球蛋白治療川崎病可能的作用機(jī)制。

2、 方法 1.內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)和實驗分組：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)按以下設(shè)計分組，A正常血清組：RPMl1640培養(yǎng)基+10％健康兒童血清；B川崎病血清組：RPMl1640培養(yǎng)基+10％川崎病急性期血清；C丙種球蛋白組：RPMl1640培養(yǎng)基+10％川崎病急性期血清+丙種球蛋白(20mg/ml)。留各組細(xì)胞刺激液，將細(xì)胞分別培養(yǎng)24，48小時后，用TRIzol溶解細(xì)胞，-70℃凍存，并收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為條件培養(yǎng)基備

3、用。 2.采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法對內(nèi)皮細(xì)胞BLT1mRNA進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物瓊脂糖凝膠中電泳后，用凝膠成像分析系統(tǒng)測定電泳條帶密度值，以β-actin為內(nèi)參照，計算BLT1基因mRNA的相對含量，結(jié)果以BLT1與β-actin條帶密度的比值表示。 3.各組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測培養(yǎng)液培養(yǎng)前后的LTB4濃度。 4.分離健康Balb/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，將細(xì)胞分

4、為正常血清條件培養(yǎng)組，川崎病血清條件培養(yǎng)組和丙種球蛋白條件培養(yǎng)組。在各組細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入上述各組內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，用0.25％胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞備檢。 5.采用流式細(xì)胞技術(shù)將消化下來的各組巨噬細(xì)胞用間接免疫熒光標(biāo)記法檢測細(xì)胞BLT2的表達(dá)。 結(jié)果 1.川崎病血清組內(nèi)皮細(xì)胞BLT1的表達(dá)水平在培養(yǎng)的第24、48小時分別為(54.23±6.25)％、(67.17±3.49)％，顯著高于正常血清

5、組(25.63±3.62)％和丙種球蛋白組(32.30±6.89)％(p＜0.05)。正常血清組和丙種球蛋白組BLT1的表達(dá)水平無顯著性差異(p＞0.05)。 2.LTB4的濃度在川崎病血清刺激48小時后為(595.6±46.4)pg/ml顯著高于刺激前的濃度(106.3±45.3)pg/ml(p＜0.05)；而在用含治療量丙種球蛋白培養(yǎng)液培養(yǎng)的上清中LTB4濃度上調(diào)不明顯。 3.川崎病血清刺激后的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠