人源DNA聚合酶Polδ最小亞基p12及相關(guān)蛋白在DNA損傷和細胞凋亡過程的調(diào)控分析.pdf

1、哺乳動物DNA聚合酶Polδ，是一個由四亞基組成的復合物，四個亞基分別是p125、p50、p68和p12。它不僅在DNA復制過程中有重要的作用，而且也參與DNA的修復和基因的重組。
　　細胞內(nèi)外各種因素可導致DNA嚴重的損傷，破壞基因組的完整性。為了應對復制壓力或基因損傷試劑造成DNA損傷，細胞自身擁有一套防御機制-DNA損傷應答(DDR)。這一機制通過募集和裝備一系列與修復相關(guān)的蛋白復合物來協(xié)調(diào)整個應答網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，包括DNA修復、

2、細胞周期檢查點的激活以及細胞的凋亡等。目前普遍認為DDR是一個復雜的過程，它能夠使DNA進行修復，固定損傷突變的位置或者通過細胞的死亡來消除損傷。就像Derks等提到的，傳感蛋白檢測到DNA損傷，并將一系列的相關(guān)因子招募到損傷點。例如修復因子等。相應的，這些感受器擴大對效應器的損傷信號，如p53和微小RNA，它們能夠控制細胞多種通路的活性，如細胞周期的停滯和凋亡。傳感器和DDR信號的轉(zhuǎn)導主要依賴于蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用以及蛋白質(zhì)翻譯后

3、的修飾。轉(zhuǎn)錄組學、全基因組RNA轉(zhuǎn)錄表達水平和蛋白質(zhì)組學的研究極大地擴展了我們對DDR的認識。研究表明，有許多其它的蛋白是檢查點激酶的靶標，在轉(zhuǎn)錄因子/微RNA的調(diào)控下，1000多個基因在DNA損傷處差異表達。因此，DDR的嚴格監(jiān)控是非常重要的。
　　當DNA受到損傷，DNA聚合酶Polδ的p12亞基發(fā)生降解，Polδ4四聚體轉(zhuǎn)換為三聚體Polδ3。當損傷無法修復時，細胞凋亡或衰老程序?qū)⒈患せ?，來去除損傷的細胞，避免突變和癌癥的發(fā)

4、生。細胞凋亡作為細胞一種基本的生命活動現(xiàn)象，不但在生物體內(nèi)去除衰老和異常的細胞中起著重要的作用，而且它在維護內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、促進生物體的進化中發(fā)揮重要的作用。
　　那么在DNA損傷中，有哪些相關(guān)蛋白參與其中呢？對應p12的下調(diào)，響應蛋白又是如何調(diào)控昵？在細胞凋亡過程中p12及相關(guān)蛋白又是如何變化的呢？因此，在本研究中，我們首先以人宮頸癌HeLa-S3細胞為實驗對象，用三種不同DNA損傷處理試劑HU(hydroxyurea)、MMS(

5、methyl methanesulfonate)、和APH(Aphidicolin)處理細胞，通過Western Blot分析，驗證前期所觀察到的DNA損傷后p12降解現(xiàn)象以及確定完全降解的時間。然后根據(jù)本實驗室前期二維電泳和質(zhì)譜分析的結(jié)果（見表Ⅰ），挑選出5個差異蛋白（包括2個上調(diào)蛋白和3個下調(diào)蛋白）在HeLa細胞中進行驗證。進一步以這三種DNA損傷處理試劑HU、MMS、和APH處理黑素瘤細胞，驗證上述差異蛋白的變化在其它細胞中是否具

6、有普遍性。最后我們用誘導細胞凋亡試劑A23187處理HeLa細胞和黑素瘤細胞，觀察Polδ的四個亞基p125、p68、p50、p12以及上述5個差異蛋白在細胞凋亡過程中的變化情況以及這種現(xiàn)象是否具有普遍性。
　　初步實驗結(jié)果表明，當HeLa細胞經(jīng)HU、MMS、和APH DNA損傷試劑處理，DNA受到損傷，p12發(fā)生降解，這與先前的研究結(jié)果相符;用HU處理HeLa細胞，對應p12的降解，我們觀察到HRF（組胺釋放因子）蛋白發(fā)生明顯上

7、調(diào)，并且HRF的上調(diào)與p12的降解密切相關(guān)，這種現(xiàn)象在黑素瘤細胞中也同樣存在，說明這種現(xiàn)象具有普遍性，而在MMS和APH處理的細胞中沒有觀察到這種現(xiàn)象，說明不同的損傷試劑造成DNA損傷的機制不同，可能引發(fā)不同的損傷應答;用HU、MMS、和APH分別處理黑素瘤細胞，ALG（細胞凋亡基因）發(fā)生不同程度的上調(diào)現(xiàn)象，而在HeLa細胞中沒有觀察到這種現(xiàn)象，說明不同的細胞應對DNA損傷的方式不同;用鈣離子載體A23187處理HeLa細胞，在細胞凋亡

8、晚期，p125、p68和p50逐漸降解，p12和ALG在不同時間段發(fā)生不同程度的上調(diào)，說明它們都參與鈣離子載體A23187引發(fā)的細胞凋亡過程，這種現(xiàn)象在黑素瘤細胞中也同樣存在，說明這種現(xiàn)象具有普遍性;用鈣離子載體A23187處理HeLa和黑素瘤細胞，我們觀察到只有在HeLa細胞中HRF發(fā)生上調(diào)，這說明不同細胞應對細胞凋亡的機制不同。
　　本研究可以加深我們對細胞如何應對DNA損傷的理解，對揭示人類癌癥的病因或由于基因的不穩(wěn)定導致的