漢防己甲素與氟康唑協(xié)同抗白念珠菌作用的比較蛋白組學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　 白念珠菌病是最常見(jiàn)的人類(lèi)機(jī)會(huì)真菌病原體，也是耳鼻喉科常見(jiàn)的一種病原體。近期感染率呈上升趨勢(shì)，在長(zhǎng)期濫用抗生素，惡性腫瘤放療與化療，艾滋病，器官移植中使用免疫抑制劑的病人中尤為顯著。而臨床治療中存在著抗真菌藥物品種少，療效不滿意，毒性大等問(wèn)題，尤其以唑類(lèi)藥物耐藥性的獲得是臨床治療白念珠菌感染失敗的主要原因。因此，抗真菌藥物增效劑的研究成為必然。本研究在既往體內(nèi)體外、基因?qū)嶒?yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用差異蛋白組學(xué)從蛋白質(zhì)水平探討漢

2、防已甲素增效作用的相關(guān)蛋白。
　　 方法：
　　 1.體外藥敏實(shí)驗(yàn)和受試菌株時(shí)間-抑菌曲線
　　 參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的M27-A真菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)方案，分別測(cè)定氟康唑單獨(dú)及聯(lián)合漢防己甲素時(shí)對(duì)16株白念珠菌酵母相的最小抑菌濃度(MIC)。選擇1株增效作用最為明顯的菌株繪制受試菌株時(shí)間-抑菌曲線，找到漢防已甲素增效的最佳藥物劑量及作用時(shí)間。
　　 2.白念珠菌裂解方法比較

3、>　　 以白念珠CA-3號(hào)菌株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用3種不同白念珠菌的裂解方法：A：裂解液裂解法+液氮反復(fù)凍融法+超聲裂解法；B：熱SDS法+液氮反復(fù)凍融法+超聲裂解法+裂解液裂解法；C：熱SDS法+玻璃珠+液氮反復(fù)凍融法+超聲裂解法+裂解液裂解法，進(jìn)行了蛋白的提取，通過(guò)倒置相差顯微鏡評(píng)價(jià)菌體的破壁率，通過(guò)蛋白提取液的濃度測(cè)定和SDS-PAGE電泳綜合對(duì)3種裂解方法進(jìn)行評(píng)估。
　　 3.漢防已甲素與氟康唑協(xié)同抗白念珠菌作用的比較蛋白

4、組學(xué)
　　 以CA-3號(hào)菌株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)二維電泳和時(shí)間-飛行質(zhì)譜儀等方法，使菌株在氟康唑(終濃度750μg/ml)、漢防已甲素(終濃度250μg/ml)和氟康唑(終濃度750μg/ml)+漢防已甲素(終濃度250μg/ml)的藥液中分別作用6h，進(jìn)行差異蛋白組學(xué)的研究。
　　 結(jié)果：
　　 1.體外藥敏實(shí)驗(yàn)和受試菌株時(shí)間-抑菌曲線
　　 與漢防己甲素聯(lián)合使用時(shí)，氟康唑敏感株，氟康唑劑量依賴株和氟康唑耐

5、藥株的MIC終點(diǎn)清晰，“拖尾現(xiàn)象”消失，聯(lián)合漢防已甲素時(shí)，對(duì)11株氟康唑敏感株，3株氟康唑劑量依賴株和2株氟康唑耐藥株均有不同程度的增效作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中CA-3的漢防己甲素增效作用最為明顯，以此菌株作為下一步的受試對(duì)象。時(shí)間-抑菌曲線結(jié)果提示當(dāng)漢防已甲素(250μg/ml)和氟康唑(750μg/ml)聯(lián)合作用6h時(shí)抑菌效果最佳。
　　 2.白念珠菌裂解方法比較
　　 通過(guò)相差顯微鏡觀察方法A、B、C的細(xì)胞裂解

6、情況，方法A破壁率明顯較方法B和方法C高，三者破壁率分別為60％、20％、15％。
　　 以Bradford法測(cè)得方法A、B、C得到的蛋白質(zhì)濃度分別為9.9±0.7，1.2±0.3，0.9±0.1 mg/ml。綜合考慮所得裂解產(chǎn)物濃度及SDS-PAGE電泳凝膠條帶的清晰度，我們選擇方法A進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　 3.漢防已甲素與氟康唑協(xié)同抗白念珠菌作用的比較蛋白組學(xué)
　　 通過(guò)3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)分別提取了氟康唑、漢防已

7、甲素和氟康唑+漢防已甲素處理后樣本的全組蛋白，確定了9個(gè)蛋白差異點(diǎn)，排除漢防已甲素組與空白組中的上調(diào)點(diǎn)15號(hào)蛋白點(diǎn)后，確定了氟康唑+漢防已甲素組和氟康唑組的8個(gè)差異蛋白點(diǎn)，通過(guò)白念珠蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，這8個(gè)蛋白分別為Pyruvate kinase，Enolase1，actin，Alcoholdehydrogenase，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，D-xylulose reductase

8、，possible sphingolipid long chain base sensory protein和一個(gè)未知蛋白。這些蛋白參與白念珠細(xì)胞壁的構(gòu)成、糖代謝和能量代謝。
　　 結(jié)論：
　　 ①漢防已甲素可能通過(guò)影響白念珠菌細(xì)胞壁的合成和抑制白念珠菌的糖酵解、能量代謝等環(huán)節(jié)中產(chǎn)物的生成，以達(dá)到協(xié)同氟康唑的增效作用。
　　 ②Adh1p與漢防已甲素的增效作用相關(guān)，可能直接或間接通過(guò)Cdr1p起到增效作用。