利福噴丁對氟康唑體外抗耐藥白念珠菌增效作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　白念珠菌是一種條件致病性真菌。近年來，由于廣譜抗生素的大量不合理應用、激素的濫用、腫瘤的化學治療及器官移植后免疫抑制劑的大量應用、免疫功能低下患者不斷增多，使真菌感染發(fā)生率大大增加，其中白念珠菌感染最常見。氟康唑因其口服吸收效果好，生物利用度高，副作用小，通常作為臨床首選治療白念珠菌感染的藥物，但隨著氟康唑的大量、頻繁使用，真菌耐藥發(fā)生率逐年上升，導致臨床治療真菌感染的失敗。
　　本課題組前期藥敏實驗發(fā)現(xiàn)利福噴丁

2、、舍曲林等聯(lián)合氟康唑時對耐氟康唑白念珠菌可能有協(xié)同作用。利福噴丁為利福霉素類抗生素，是治療結核病的一線用藥，抗結核桿菌作用比利福平強，且藥物不良反應比利福平小。到目前為止，關于利福噴丁體外抗真菌協(xié)同作用的研究較少，因此，開展利福噴丁聯(lián)合氟康唑體外抗白念珠菌的效應研究，為臨床治療白念珠菌感染探索有效方法。
　　方法：
　　第一部分:參考M27-A2方案中的微量液基稀釋法測定利福噴丁、氟康唑單用及兩藥合用時對白念珠菌的最低抑菌濃

3、度(MIC);用棋盤式測定利福噴丁聯(lián)合氟康唑體外抗白念珠菌的效應。通過時間—生長曲線實驗、Spot assay實驗驗證利福噴丁對氟康唑體外抗耐藥白念珠菌的增效作用，并摸索后續(xù)實驗研究所需的藥物濃度。
　　第二部分:應用透射電鏡觀察白念珠菌100分別在利福噴丁、氟康唑單藥及兩藥聯(lián)合作用前后超微結構的變化。
　　第三部分:應用流式細胞儀檢測白念珠菌100分別在利福噴丁、氟康唑單藥及兩藥聯(lián)合作用前后細胞周期的變化。
　　結果

4、：
　　第一部分:利福噴丁單藥對實驗所選12株白念珠菌均無抗菌活性(MIC80＞1024μg/mL)。在氟康唑敏感白念珠菌株中，利福噴丁聯(lián)合氟康唑后未表現(xiàn)出協(xié)同效應(FICI＞0.5);在氟康唑耐藥白念珠菌中，利福噴丁聯(lián)合氟康唑后均表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用(FICI＜0.1)，本試驗所研究的菌株中，利福噴丁對氟康唑體外抗白念珠菌100的增效作用最好，故后續(xù)實驗選用該菌株作為研究對象。生長曲線顯示氟康唑耐藥白念珠菌100在4～12h為生

5、長對數(shù)期，之后進入生長的穩(wěn)定期和衰退期。與生長對照組相比，單用藥組對氟康唑耐藥白念珠菌100生長無明顯抑制作用，合藥組顯示出明顯的抑制作用。利福噴丁(125ug/mL)與不同藥物濃度的氟康唑(4、16、64ug/mL)聯(lián)合應用時，對白念珠菌100的抑制作用不隨著氟康唑劑量的增加而增強;不同藥物濃度的利福噴丁(15.63、31.25、125ug/mL)與氟康唑(4ug/mL)合用時，利福噴丁濃度越高，對氟康唑耐藥白念珠菌100的抑制作用越

6、強。
　　第二部分:透射電鏡結果顯示生長對照組的菌體形態(tài)規(guī)則，細胞結構完整、清晰，呈圓形或橢圓形，細胞壁光滑，胞膜結構連續(xù)，清晰可見，胞核及線粒體正常;利福噴丁組細胞形態(tài)基本正常，邊界清楚，部分細胞見胞核腫脹不規(guī)則，未見明顯空泡液泡;氟康唑組大多數(shù)細胞形態(tài)基本正常，部分細胞胞壁電子密度不均勻分布，透明層局灶性增厚，胞膜粗糙，可見腫脹的線粒體，核質(zhì)相對分明，可見少量空泡、液泡;聯(lián)合用藥組大部分細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞壁的電子透明層厚薄不

7、一，細胞膜與細胞壁分離，層次不清，邊界模糊，胞膜嚴重缺損，線粒體腫脹，核質(zhì)界限不清，許多大小不等的團塊狀物質(zhì)聚集于細胞膜附近，核膜斷裂、溶解消失，胞核集聚不規(guī)則，凝聚成團。
　　第三部分:通過流式細胞術檢測藥物作用12h、24h對耐氟康唑白念珠菌100細胞周期各期DNA含量變化。作用12h時，空白對照組、利福噴丁組、氟康唑組及合藥組在G0/G1期細胞計數(shù)百分比分別為:(76.41±1.52)％、（75.48±1.41）％、（72.

8、36±1.01）％、（8.11±0.22）％，S期細胞計數(shù)百分比分別為:（5.46±0.73）％、（8.46±0.23）％、（6.86±0.56）％、（12.52±0.54）％，G2/M期細胞計數(shù)百分比分別為:（18.14±1.11）％、（16.06±1.37）％、（20.78±1.48）％、（79.37±0.52）％;作用24h時，空白對照組、利福噴丁組、氟康唑組及合藥組在G0/G1期細胞計數(shù)百分比分別為:(82.36±1.25)％、

9、（70.52±3.11）％、（60.45±1.07）％、（8.11±0.22）％，S期細胞計數(shù)百分比分別為:（6.03±0.92）％、（12.15±1.92）％、（15.19±1.23）％、（7.79±1.45）％，G2/M期細胞計數(shù)百分比分別為:（11.61±0.86）％、（17.33±1.32）％、（24.36±0.40）％、（86.26±0.94）％，兩藥合用組比生長對照組及單用藥組G0/G1期細胞數(shù)顯著減少(p＜0.01)，G2

10、/M期細胞數(shù)顯著增多(p＜0.01)，表明聯(lián)合用藥組細胞周期阻滯在G2/M期，通過對12h、24h兩個時間點對比發(fā)現(xiàn)，藥物對白念珠菌100細胞周期的影響大體一致。
　　結論：
　　利福噴丁單用時無抗白念珠菌活性，但利福噴丁能顯著增強氟康唑抗耐氟康唑白念珠菌活性，說明利福噴丁對氟康唑體外抗耐藥白念珠菌具有增效作用。通過透射電鏡觀察各組細胞超微結構推測，利福噴丁可能影響RNA或DNA的合成，也可能直接抑制真菌細胞膜上的某種酶的活

11、性，從而發(fā)揮其對氟康唑體外抗耐藥白念珠菌的增效作用。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)兩藥合用時可將細胞周期阻滯在G2/M期，抑制真菌細胞的正常分裂增殖。本課題組首次發(fā)現(xiàn)利福噴丁對氟康唑體外抗氟康唑耐藥白念珠菌具有增效作用，聯(lián)合用藥時抗真菌作用機制比較復雜，本階段實驗初步探索了利福噴丁對氟康唑體外抗耐藥白念珠菌的增效作用機制，本課題組將在后續(xù)研究中通過檢測胞膜甾醇含量、胞內(nèi)藥物含量及相關基因表達等實驗進一步探索利福噴丁對氟康唑抗耐藥白念珠菌增效作用機制