日本血吸蟲表膜蛋白TSP的多態(tài)性分析和功能研究及電穿孔法介導(dǎo)惡性瘧疾DNA疫苗與不同佐劑配伍的免疫效果比較.pdf

1、血吸蟲病嚴(yán)重威脅人類的健康,全球76個發(fā)展中國家仍有血吸蟲病的流行,約有2億血吸蟲病患者。血吸蟲體被(tegument)是蟲體與宿主直接接觸的表面,介導(dǎo)與宿主相互作用。對血吸蟲表膜(tegument surface membrane)蛋白的研究,有助于了解血吸蟲免疫逃避、免疫調(diào)節(jié)、營養(yǎng)攝取等機(jī)制,進(jìn)而有可能發(fā)現(xiàn)新的干涉靶點。血吸蟲體被存在著表達(dá)廣泛且多樣的四次跨膜蛋白家族(tetraspanin,TSP),曼氏血吸蟲四次跨膜蛋白家族成員

2、被認(rèn)為是具有保護(hù)潛力的抗原分子,其中Sm-TSP-2更是獲得高達(dá)～60％的保護(hù)力；而其在日本血吸蟲中的同源分子Si-TSP-2且存在廣泛的多態(tài)性,與免疫逃避相關(guān),提示這兩個物種在進(jìn)化過程中發(fā)生的歧化作用。因此,有必要對日本血吸蟲的四次跨膜蛋白家族成員展開深入研究,希望找到針對日本血吸蟲的新的抗原和藥物靶點。
　　 本研究首先利用生物信息學(xué)方法在日本血吸蟲中共鑒定了29個四次跨膜蛋白家族(Sj-TSP)成員。其中,除Sj-tsp-

3、2和Sj-25外,新發(fā)現(xiàn)3個Sj—tsp基因存在不同程度的變異體；另外,2個Sj-tsp存在選擇性剪接,提示可能參與血吸蟲逃避宿主免疫反應(yīng)的過程,不適合作為抗原候選分子。
　　 實時熒光定量PCR表明不同Sj-tsp基因在尾蚴、肺期童蟲、雌雄成蟲和蟲卵中呈多態(tài)性轉(zhuǎn)錄；肺期童蟲是對宿主免疫攻擊最敏感的發(fā)育期,這一時期Sj-tsp基因的表達(dá)受到關(guān)注。其中,12種Sj—tsp基因在童蟲的相對較高水平表達(dá),(相對tubulin>1),7

4、種Si-tsp基因的表達(dá)在尾蚴入侵宿主后呈顯著增加,說明這7種分子對以適應(yīng)宿主體內(nèi)環(huán)境發(fā)揮一定的作用,但其中2種是變異基因分別是Sj-tsp-2和Sj25,另有1種為Sj-tsp-7存在選擇性剪接,被認(rèn)為是Sj-tsp基因既要在宿主體內(nèi)發(fā)揮功能,又要逃避宿主攻擊所采取的策略。
　　 體外對保守且童蟲期表達(dá)的19個Sj-tsp基因成功進(jìn)行RNAi,并探討其對蟲體的潛在影響。其中,4種Sj-tsp基因的沉默效率在80％以上,9種Sj

5、-tsp基因的沉默效率在40％-60％之間。但以上Sj-tsp抑制以后,童蟲的表膜完整性不受影響,且生存率與對照組相比無顯著差異,提示Sj-tsp基因可能在體內(nèi)發(fā)揮與宿主相互作用的功能,而體外則檢測不到其抑制后對童蟲的影響。
　　 綜合以上結(jié)果,基于Sj-tsp家族成員的保守性,分期轉(zhuǎn)錄水平、大親水環(huán)半胱氨酸數(shù)目等分子特征,我們初步篩選出5個具有潛力的Sj-tsp基因,為進(jìn)一步的免疫保護(hù)試驗奠定基礎(chǔ)。
　　 瘧疾是當(dāng)今世

6、界對人類危害最為嚴(yán)重的傳染性疾病之一。全球每年有3億-5億人感染惡性瘧,有100萬-300萬人因這一疾病而死亡,其中大多數(shù)為非洲撒哈拉以南地區(qū)5歲以下的兒童。近年來,由于耐藥瘧原蟲株和耐藥蚊媒的不斷產(chǎn)生和擴(kuò)散,使瘧疾控制形勢更為嚴(yán)峻。因此,研制安全有效的瘧疾疫苗,成為控制瘧疾的重要手段。
　　 本課題組前期工作借鑒了分子育種技術(shù)(即DNA改組)的隨機(jī)重組原理,利用表位改組技術(shù)構(gòu)建了多表位基因庫,并用庫免疫血清篩選出高抗原性的陽性

7、克隆,發(fā)現(xiàn)其中VR312(改名為M.RCAg-1)基因克隆不僅能在小鼠模型誘導(dǎo)交叉免疫保護(hù)而且能在家兔模型中誘導(dǎo)抗惡性瘧原蟲抑制性抗體；D10基因克隆在家兔模型中誘導(dǎo)抗惡性瘧原蟲抑制性抗體。
　　 本實驗通過采用優(yōu)化的DNA真核表達(dá)載體、電穿孔的免疫途徑,結(jié)合4—1BBL和西咪替丁這兩種佐劑等方面改進(jìn)DNA疫苗的免疫效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)電穿孔的免疫途徑在低劑量時即可誘導(dǎo)高水平的抗體滴度；pVAX1表達(dá)載體的免疫效果比VR1012表達(dá)載