KIM-1在組織特異性轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型中的病理生理作用.pdf

1、研究背景：腎損傷分子-1(Kidney Injury Molecular-1，KIM-1)，也被稱為T細胞免疫球蛋白及粘蛋白1(T cell Ig and Mucin-1，TIM-1)或A型肝炎病毒的細胞受體-1（A virus cellular receptor-1，Havcr-1），是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白基因超家族。KIM-1在正常腎組織中檢測不到，而在急性受損后的近曲小管上皮細胞頂端表面顯著表達。作為一個非髓性磷脂酰

2、絲氨酸(phosphatidylserine，PS)的受體，KIM-1胞外域能結(jié)合并內(nèi)化氧化的脂質(zhì)體，以及管腔凋亡細胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸。通過這種方式，KIM-1能輔助清除管腔中的細胞碎片，促進腎小管的修復與組織再造。近年來研究表明，KIM-1也在多種慢性腎臟病的動物模型表達上調(diào)，包括蛋白質(zhì)過載腎病，阿霉素腎病，血管緊張素Ⅱ誘導的腎損傷和小鼠多囊腎，其表達與纖維化和炎癥區(qū)域重疊。在人類慢性腎臟病中，KIM-1表達上調(diào)與人類同種異體移

3、植腎間質(zhì)纖維化直接相關。在急性腎損傷（Acute Kidney Injury，AKI）及其衍發(fā)地慢性腎臟疾病(Chronic Kidney Disease，CKD)中KIM-1表達與炎癥和纖維化區(qū)域高度重疊，其流行病學關聯(lián)研究表明，KIM-1可能在連接急性腎損傷向慢性腎病和腎纖維化演變中發(fā)揮重要作用。同樣，在腎組織特異性過表達KIM-1的轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)腎小管損害，腎單位減少數(shù)量，纖維化，高死亡率和心肌肥厚。KIM-1能迅速、靈敏、特異地

4、反映各種腎臟疾病的損傷及恢復過程，已成為一種檢測早期腎損傷的可靠生物學標記物在臨床上廣泛應用，然而其在腎臟疾病中發(fā)生發(fā)展中的病理生理作用仍然不是很明確。
　　斑馬魚(zebrafish)，熱帶淡水魚的一種，已經(jīng)成為一個好的脊椎動物模型，應用于人類疾病，遺傳學和生長發(fā)育的研究。大約70％的人類疾病基因，在結(jié)構(gòu)和功能上與斑馬魚高度同源。由于斑馬魚的腎臟結(jié)構(gòu)比較簡單，包括幼蟲時期的前腎及成魚時期發(fā)展的中腎，斑馬魚已成為一種非常流行的研究

5、模型，用于急性腎損傷，多囊腎(Polycystic Kidney Disease，PKD)，腎小球腎炎和一系列小管纖毛疾病的研究。同時，斑馬魚繁殖發(fā)育迅速，易于基因改造及其光學透明性，使其成為探討及研究KIM-1介導的急性和慢性腎臟改變的理想模型。
　　在這項研究中，通過使用基因組及生物進化分析，我們發(fā)現(xiàn)并證明了斑馬魚Kim-1基因家族由zKim-1，zKim-3和zKim-4組成。zKim-1的結(jié)構(gòu)和功能與哺乳動物KIM-1高度

6、同源。通過創(chuàng)建腎小管上皮細胞特異性過表達Kim-1斑馬魚模型及Cre介導地可調(diào)節(jié)性腎小管上皮細胞特異性過表達Kim-1斑馬魚模型，我們證實持續(xù)性過表達KIM-1在腎小管上皮細胞中的病理生理作用。
　　第一章zKim家族基因序列對比及zKim-1剪接變體鑒定
　　目的：在斑馬魚全基因組中尋找Kim家族系列基因，探討Kim家族系列基因在斑馬魚基因組中的分布情況，為Kim-1蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚奠定分子基礎。
　　方法：在多種

7、公共蛋白及cDNA數(shù)據(jù)庫中搜索Kim家族基因序列，如Ensembl人類基因組瀏覽器(Ensembl GenomeBrowser,http://useast.ensembl.org/Daniorerio/Info/Index);GenBank，美國國家生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information, NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank

8、）以及UCSC基因組瀏覽器（UCSC Genome Browser，http://genome.ucsc.edu）等。采用不同的同源性基因比對程序，篩選與人類及哺乳動物的KIM家族基因序列同源相似性程度較高的斑馬魚KIM家族基因序列。通過cDNA基因序列，蛋白質(zhì)編碼序列及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能比對情況，確定Kim家族系列基因。通過對目的基因cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)，確定z

9、Kim-1可能存在的剪接變體。
　　結(jié)果：應用NCBI/BLAST項目，從EMBL，Genbank andUCSC數(shù)據(jù)中，找到并證實了zKim-1(EMBL accession numberENSDARG00000091692),zKim-3(ENSDARG00000077257), andzKim-4(ENSDARG00000040178)三個Kim家族基因，位于21號染色體。其系統(tǒng)同源性分析表明zKim-1，zKim-3，zK

10、im-4分別與hKIM-1，hKIM-3，hKIM-4在序列及結(jié)構(gòu)上高度同源。cDNA末端快速擴增結(jié)果顯示zKim-1存在的三個剪接變體，分別命名為長鏈zKim-1(zKim-1-L)，短鏈zKim-1（zKim-1-S）及免疫球蛋白zKim-1（zKim-1-Ig）。
　　結(jié)論：1.首次發(fā)現(xiàn)并證實KIM家族基因在斑馬魚全基因組的分布情況。2.斑馬魚KIM家族基因序列具有與人類KIM家族基因序列高度同源性。3.蛋白結(jié)構(gòu)上，斑馬魚K

11、IM家族基因同樣具有胞外信號肽，免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，粘蛋白結(jié)構(gòu)域及胞內(nèi)區(qū)酪氨酸磷酸化位點。4.zKim-1存在的三個剪接變體，即長鏈zKim-1（zKim-1-L），短鏈zKim-1（zKim-1-S）及免疫球蛋白zKim-1(zKim-1-Ig)。
　　第二章zKim家族基因在斑馬魚各個組織器官中的表達情況及zKim-1蛋白表達調(diào)節(jié)及功能分析
　　目的：分析KIM家族基因及zKim-1剪接變體（長鏈zKim-1，短鏈zKi

12、m-1，免疫球蛋白zKim-1），在斑馬魚各個組織器官中的分布情況。依據(jù)，在腎臟損傷后，KIM-1在近曲腎小管上皮細胞顯著表達的調(diào)節(jié)機制，探討zKim-1是否具有與人類KIM-1蛋白相似的表達調(diào)節(jié)機制。體外實驗，分析zKim-1是否具有與人類KIM-1蛋白相似的吞噬調(diào)亡細胞殘骸及氧化脂質(zhì)體的清理功能。
　　方法：通過，實時定量PCR分析Kim家族系列基因及zKim-1剪接變體（長鏈zKim-1，短鏈zKim-1，免疫球蛋白zKim

13、-1），在斑馬魚各個組織器官中的分布情況。依據(jù)zKim-1在腎臟損傷后在近曲腎小管上皮細胞顯著表達的調(diào)節(jié)機制，采用實時定量PCR，免疫熒光染色及免疫組化分析在慶大霉素導致急性腎臟損傷斑馬魚模型中zKim-1及其剪接變體表達調(diào)節(jié)情況。體外，與調(diào)亡細胞殘骸及氧化脂質(zhì)體共同培養(yǎng)，分析zKim-1表達細胞是否具有與人類KIM-1蛋白相似的吞噬功能。
　　結(jié)果：KIM家族基因在斑馬魚中各個正常器官中只有較少量表達，其中zKim-1在斑馬魚的

14、鰭表達稍多，zKim-3在肌肉中表達稍多。zKim-1在損傷后的腎小管表達明顯增加，而zKim-3，zKim-4的表達無明顯變化，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。zKim-1具有對凋亡細胞及氧化脂質(zhì)體的內(nèi)吞作用。
　　結(jié)論：1.在健康正常組織中，KIM家族基因表達微量或檢測不到。2.zKim-1具有與人類KIM-1蛋白相似的表達調(diào)節(jié)機制，即在腎臟損傷后，zKim-1顯著表達于近曲腎小球上皮細胞。3.體外實驗證實，zKim-1具有與人

15、類KIM-1蛋白相似的吞噬凋亡細胞殘體及氧化脂質(zhì)體的清理功能。
　　第三章 Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型構(gòu)建及表型分析
　　目的：構(gòu)建腎小管上皮細胞特異性表達Kim-1蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，探討Kim-1表達對斑馬魚幼苗的前腎單位及斑馬魚成魚的中腎單位的影響。
　　方法：首先，體外構(gòu)建腎小管上皮細胞特異性表達zKim-1質(zhì)粒載體。通過，分子克隆構(gòu)建zKim-1與紅色熒光融合蛋白線性基因片段。通過，特異性酶切位點，分子亞克隆

16、將zKim-1耦合紅色熒光蛋白基因(zKim-1-RFP)植入腎小管上皮細胞特異性表達載體質(zhì)粒。我們采用在腎小管上皮細胞特異性表達的鈣粘蛋白17(Cadherin17，cdh17)的啟動子，介導zKim-1耦合紅色熒光蛋白在斑馬魚幼苗的前腎單位及斑馬魚成魚的中腎單位中表達。通過顯微鏡下納米注射方法，將腎小管上皮細胞特異性表達zKim-1載體質(zhì)粒導入斑馬魚的單細胞階段的胚胎組織，并在熒光顯微鏡下實時觀察zKim-1耦合紅色熒光蛋白的表達情

17、況。對照組，分子克隆構(gòu)建鈣粘蛋白17介導的腎小管上皮細胞特異性表達紅色熒光蛋白，且無zKim-1整合基因序列的表達載體。同樣，采用通過顯微鏡下納米注射方法構(gòu)建對照組斑馬魚模型。免疫印跡試驗鑒別并驗證Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型，并檢測Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的各項生理病理指標，包括斑馬魚幼苗的活動反映情況，心包積液及全身水腫表現(xiàn)。檢測右旋糖酐在Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型及對照組中腎小球濾過情況，反映斑馬魚幼苗的腎功能情況。通過，蘇木素伊

18、紅染色檢測Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型及對照組的腎臟病理改變。免疫熒光染色檢測相關蛋白的表達情況及其與zKim-1的相互關系。電子顯微鏡下進一步分析Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型及對照組腎臟微觀病理改變。
　　結(jié)果：與對照組比較，Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型組出現(xiàn)明顯的活動反映減弱。Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚出現(xiàn)明顯的心包積液及全身水腫，其嚴重程度與zKim-1在腎臟組織中的表達明顯正相關。Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚的腎功能出現(xiàn)顯著下降，其右旋糖

19、酐在腎小球的濾過情況明顯延遲。Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚的存活比例明顯低于對照組，并與zKim-1在腎臟組織中的表況密切相關。腎臟病理方面，Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚的腎小管形態(tài)不規(guī)則，管腔消失，可見部分腎小管上皮細胞脫落，水腫及空泡化。免疫熒光染色顯示，在Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型中，表達zKim-1的腎小管上皮細胞出現(xiàn)活化caspase3表達陽性。電子顯微鏡結(jié)果顯示，Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚的腎小管上皮細胞刷狀緣脫落，胞漿中可見大量吞噬小體并

20、伴有部分細胞核固縮。
　　結(jié)論：1.首次成功構(gòu)建Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型，可成為潛在的生物藥學的研究工具，為人類急性慢性腎臟疾病的治療提供新的靶點。2.Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚出現(xiàn)多種近期及遠期腎臟損傷表現(xiàn)，其對研究Kim-1在腎臟疾病中的急性慢性腎臟損傷的發(fā)生發(fā)展研究具有重要意義。3.腎小管上皮細胞特異性表達Kim-1誘導腎臟損傷，可能與Kim-1受體介導吞噬腎小管管腔中的一些潛在毒性或非毒性的蛋白質(zhì)，導致細胞應激損傷。

21、　　第四章條件性Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型構(gòu)建及持續(xù)性Kim-1表達在腎臟損傷中的病理生理作用
　　目的：構(gòu)建腎小管上皮細胞條件性表達Kim-1蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，探討Kim-1表達對斑馬魚幼苗的前腎單位及斑馬魚成魚的中腎單位的影響。
　　方法：通過Cre/Loxp位點重組酶原理構(gòu)建轉(zhuǎn)基因斑馬魚。首先，體外構(gòu)建構(gòu)建表達的zKim-1與紅色熒光融合蛋白線性基因片段。分子克隆構(gòu)建zKim-1與紅色熒光融合蛋白線性基因片段，特異性

22、酶切位點，將zKim-1耦合紅色熒光蛋白基因植入泛素(ubiquitin，ubi)啟動的依賴Cre重組酶活性介導的加強綠色熒光蛋白與zKim-1耦合紅色熒光蛋白替換的表達載體質(zhì)粒。其次，體外構(gòu)建構(gòu)建腎小管上皮細胞特異性表達Cre的載體質(zhì)粒。分子克隆構(gòu)建Cre的線性基因片段，植入腎小管上皮細胞特異性表達的鈣粘蛋白17(Cadherin17，cdh17)作為啟動子的表達載體質(zhì)粒。通過顯微鏡下納米注射方法，將表達載體質(zhì)粒導入斑馬魚的單細胞階段

23、的胚胎組織，三個月后獲得鈣粘蛋白17介導的Cre轉(zhuǎn)基因斑馬魚(cdh17: Cre)及啟動的依賴Cre重組酶活性介導的加強綠色熒光蛋白與zKim-1耦合紅色熒光蛋白替換的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(ubi:Loxp-EGFP-Loxp-zKim-1-RFP)。cdh17:Cre轉(zhuǎn)基因斑馬魚與ubi:Loxp-EGFP-Loxp-zKim-1-RFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚雜交后獲得腎小管上皮細胞可調(diào)節(jié)性表達的Kim-1蛋白的雙基因雜交斑馬魚。監(jiān)測Kim-1可調(diào)節(jié)

24、性雙基因雜交斑馬魚的各項生理病理指標，包括斑馬魚幼苗的活動反映情況，心包積液及全身水腫表現(xiàn)。通過，蘇木素伊紅染色檢測Kim-1可調(diào)節(jié)性雙基因雜交斑馬魚的腎臟病理改變。免疫熒光染色檢測相關蛋白的表達情況及其與zKim-1的相互關系。電子顯微鏡下進一步分析Kim-1可調(diào)節(jié)性雙基因雜交斑馬魚的腎臟病理改變。
　　結(jié)果：與對照組比較，Kim-1可調(diào)節(jié)性雙基因雜交斑馬魚同樣出現(xiàn)明顯的活動反映減弱，其心包積液及全身水腫的嚴重程度與zKim-1

25、在腎臟組織中表達成顯著正相關。Kim-1可調(diào)節(jié)性雙基因雜交斑馬魚的存活比例明顯低于對照組，與zKim-1在腎臟組織中表達程度有關。腎臟病理方面，Kim-1可調(diào)節(jié)性雙基因雜交斑馬魚同樣出現(xiàn)的腎小管形態(tài)不規(guī)則，管腔消失，可見部分腎小管上皮細胞脫落，水腫及空泡化。免疫熒光染色顯示，在Kim-1可調(diào)節(jié)性雙基因雜交斑馬魚模型中，表達zKim-1的腎小管上皮細胞出現(xiàn)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶缺口末端標記(Terminal deoxynucleotidyl

26、transferase dUTP nick end labeling，TUNEL)陽性。電子顯微鏡結(jié)果同樣顯示，腎小管上皮細胞刷狀緣脫落，胞漿中可見大量吞噬小體并伴有部分細胞核固縮。
　　結(jié)論：1.首次成功構(gòu)建可調(diào)節(jié)性Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型，排除Kim-1表達對斑馬魚前腎單位發(fā)育的影響因素，觀察Kim-1表達對腎小管上皮細胞損傷的直接影響。2.可調(diào)節(jié)性Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚可作為潛在的動物模型，應用于研究Kim-1在不同疾病背