肌肉細胞特異性增強因子2A（MEF2A）在斑馬魚心臟和體節(jié)發(fā)育中的作用.pdf

1、肌肉細胞特異性增強因子2基因(Myocytespecifific-enhancerfactor2，MEF2)廣泛存在于果蠅、斑馬魚、小鼠和人類中。在小鼠和人類中，MEF2基因家族至少存在4個成員：MEF2A,MEF2B,MEF2C和MEF2D。其中MEF2A在骨骼肌細胞的發(fā)育、分化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。人類家系遺傳分析表明突變的MEF2A是冠狀動脈粥樣硬化的致病基因之一，這一致病基因的發(fā)現(xiàn)為研究冠心病的發(fā)病機理、開發(fā)預防和治療相關(guān)的新藥

2、具有重要價值。分子遺傳學篩查發(fā)現(xiàn)冠心病患者中近2﹪可能攜帶有MEF2A突變基因，這就提示MEF2A基因突變與冠心病及心梗有直接相關(guān)性，MEF2A基因在冠心病發(fā)病過程中有重要功能，但具體機制尚不清楚。最近，上述結(jié)論引起爭議。MEF2A基因敲除小鼠出生后死于猝死，MEF2A雜合性突變體小鼠出生后發(fā)育正常，MEF2A-/-小鼠死因不明。 模式生物作為研究基因功能的一種新型的研究方法，斑馬魚胚胎透明、體外發(fā)育、個體小、繁殖率高、產(chǎn)卵時

3、間長、以及魚種發(fā)育遺傳背景清晰等優(yōu)點使其正成為研究脊椎動物發(fā)育生物學、發(fā)育遺傳學的理想模式生物。斑馬魚屬于脊椎動物，其心血管、血液、消化道、肝臟、腎臟以及視覺系統(tǒng)與人類相應系統(tǒng)有許多共同特點。用該模型闡明早期發(fā)育、器官形成、系統(tǒng)生理學、藥理學和復雜疾病等問題均切實可行。2000年，Nasevicius等提出了注射嗎啡啉修飾性寡核苷酸可獲得基因下調(diào)斑馬魚。嗎啡啉有抑制翻譯的起始，減少傳統(tǒng)反義寡核苷酸非特異性的效應。注射嗎啡啉能夠產(chǎn)生以往證

4、實的基因突變的擬表型，有助于確定未知功能的基因。嗎啡啉寡核苷酸正在成為快速、高效的基因敲除方法，使經(jīng)典反向遺傳學方法應用于斑馬魚。 斑馬魚具有許多適合心血管系統(tǒng)疾病研究的優(yōu)勢，斑馬魚的心臟容易觀察和便于操作，更有意義的是，由于它的胚胎小，可以不依賴于有功能的心血管系統(tǒng)，甚至在整個心血管循環(huán)缺失的情況下，它仍然能通過對氧的被動運輸而生存，繼續(xù)發(fā)育一段時間，這就可以活體觀察心血管系統(tǒng)有嚴重缺陷的突變體，為心血管發(fā)育遺傳學研究提供極

5、為有利條件亡，此外，斑馬魚與人類的心臟發(fā)育具有極其相似的基因調(diào)控途徑，因此進行斑馬魚的心臟發(fā)育機制研究，對揭示人類心臟發(fā)育的基因調(diào)控機理有重要的啟示意義，這使得斑馬魚成為進行心臟發(fā)育生物學研究的重要模式動物之一，極大地推動心血管疾病發(fā)病機制的研究。 應用斑馬魚正向遺傳學(forwardgenetics)研究已鑒定了多個影響心臟收縮功能的突變體。突變體weakatrium心房停止跳動，而心室正常節(jié)律性收縮；silentheart

6、是心臟收縮功能缺陷最嚴重的突變體，其心房和心室都停止跳動，但心房和心室外形發(fā)育正常；突變體quietheart心房和心室?guī)缀跬Ｖ固鴦?，但心房和心室外形發(fā)育正常；突變體stretched心房和心室跳動但無血液循環(huán)，胚胎發(fā)育到48小時時，純合子突變體stretched嚴重水腫，整個心臟形成針樣結(jié)構(gòu)。定位克隆結(jié)果證明上述突變基因是形成肌節(jié)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的相應編碼基因，心肌肌原纖維由粗、細肌絲規(guī)律排列組成，心肌肌節(jié)是心肌收縮的基本元件，肌絲的滑動

7、是心肌收縮的動力基礎(chǔ)。構(gòu)成肌節(jié)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)突變可導致擴張型心肌病或肥厚型心肌病，甚至心力衰竭。到目前為止，在大規(guī)模斑馬魚遺傳篩選中，還沒有突變體的突變基因遺傳定位到MEF2A位點。 BMP-2是參與胚胎早期分化發(fā)育的又一個因子，有趣的是，發(fā)育后期機體BMP-2基因仍有表達，提示BMP-2基因在發(fā)育后期仍有生物學功能，但BMP-2基因敲除小鼠在早期胚胎7.0-10.5天時就死亡，妨礙了探討B(tài)MP-2基因在發(fā)育后期的功能。

8、 到目前為止，還沒有直接的遺傳學證據(jù)表明BMP-2調(diào)節(jié)心臟收縮。本研究得利于斑馬魚在心血管發(fā)育遺傳學中的優(yōu)勢，BMP-2基因敲除小鼠在早期胚胎死亡，所以用小鼠模型研究發(fā)育后期BMP-2基因功能很困難。相反，斑馬魚胚胎發(fā)育并不完全依賴有功能的心血管系統(tǒng)，環(huán)境中的氧可以擴散進入胚胎機體。這就為探討B(tài)MP-2基因功能提供可能。我們實驗證明，心肌細胞可以合成并分泌BMP-2，BMP-2不僅是背腹分化所必需的，也是維持心臟收縮所不可缺的。

9、 新生大鼠心肌細胞模型作為一種體外實驗研究模型，可以更方便地從細胞和分子水平研究心血管疾病的發(fā)病機制，成為心血管疾病研究的一項主要手段和基本技術(shù)。 體節(jié)發(fā)育過程受多種遺傳因子調(diào)節(jié)，有趣的是斑馬魚前6個體節(jié)每20分鐘形成1個體節(jié)，而后24個體節(jié)每30分鐘形成1個體節(jié)，表明前部體節(jié)和后部體節(jié)發(fā)育機理不完全相同。斑馬魚大規(guī)模遺傳篩選獲得多個體節(jié)發(fā)育缺陷突變體，還沒有突變體遺傳定位到MEF2A位點。 第一部分MEF2A在

10、斑馬魚心臟發(fā)育中的作用 本部分研究擬利用斑馬魚在心血管發(fā)育遺傳學優(yōu)勢，探討MEF2A基因在斑馬魚心臟發(fā)育中的作用。 首先，利用RT-PCR，胚胎整體原位雜交和MEF2A：GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚的動態(tài)分析等多種手段探討MEF2A在胚胎發(fā)育中的表達模式，表明MEF2A在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中在心臟及體節(jié)中有表達，在心臟中的表達提示MEF2A在心臟發(fā)育中有某種特定功能。 其后，利用嗎啡啉修飾的寡核苷酸技術(shù)在整體水平下調(diào)

11、(knock-down)MEF2A基因的表達，探討其異常表型及其機制。發(fā)現(xiàn)： 1.胚胎發(fā)育到48小時時，胚胎心臟形態(tài)發(fā)生正常。但心臟收縮頻率降低，心室收縮指數(shù)降低，心肌收縮力降低，整體動物實驗提示MEF2A參與心臟的收縮功能。 2.心肌電鏡結(jié)果提示MEF2A參與心肌肌節(jié)的組裝，MEF2A功能下調(diào)導致心肌肌節(jié)的組裝紊亂，細胞水平證明MEF2A的功能完整是心臟正常收縮所必需的。 3.Real-TimePCR、原

12、位免疫熒光實驗技術(shù)顯示MEF2A的表達下調(diào)能導致參與心肌收縮基因的表達異常，這些收縮基因的表達產(chǎn)物收縮蛋白是形成心肌肌節(jié)的基本元件，是參與心肌收縮的動力裝置。從分子水平證明MEF2A參與心臟的收縮功能。 第二部分BMP2作用于MEF2A上游調(diào)節(jié)心臟收縮 第一部分我們提供了MEF2A調(diào)節(jié)心臟收縮的功能的遺傳學基礎(chǔ)，MEF2A作為一個轉(zhuǎn)錄因子，其上游的調(diào)節(jié)機制還很少有報道。 本部分研究綜合利用斑馬魚和心肌細胞模

13、型，首先，分析了斑馬魚、大鼠和人的BMP-2和MEF2A高度同源；其次，證明BMP-2和MEF2A在胚胎心臟中共同表達；再次，提供BMP2調(diào)節(jié)心臟收縮的遺傳學證據(jù)；第四，用生化手段證明BMP-2可以調(diào)控新生大鼠心室心肌細胞MEF-2A的表達；第五，用功能恢復手段證明MEF2A作用于BMP2下游調(diào)節(jié)心臟收縮；第六，提出BMP2-MEF2A通路調(diào)節(jié)心臟收縮的模型，分析靶向BMP2-MEF2A通路可以為心力衰竭的防治提供新的手段。

14、第三部分MEF2A在斑馬魚體節(jié)發(fā)育中的作用 第一部分我們證明MEF2A在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中在體節(jié)中有表達，在體節(jié)中的表達提示MEF2A在體節(jié)發(fā)育中有某種特定功能。 體節(jié)發(fā)育過程受多種遺傳因子調(diào)節(jié)，有趣的是斑馬魚前6個體節(jié)每20分鐘形成1個，而后24個體節(jié)每30分鐘形成1個，表明前部體節(jié)和后部體節(jié)發(fā)育機理不完全相同。斑馬魚大規(guī)模遺傳篩選獲得多個體節(jié)發(fā)育缺陷突變體，還沒有突變體遺傳定位到MEF2A位點。 本部

15、分研究利用斑馬魚在體外發(fā)育、胚胎透明、發(fā)育快速的特點，探討MEF2A基因在斑馬魚在體節(jié)的作用。利用嗎啡啉修飾的寡核苷酸技術(shù)在整體水平下調(diào)MEF2A基因的表達，探討體節(jié)發(fā)育缺陷表型其異常表型，發(fā)現(xiàn) 1.斑馬魚胚胎MEF2A下調(diào)后尾部向下彎曲，形成U型的后部體節(jié)； 2.MEF2A是Hedgehog通路所必需的，盡管MEF2A不影響shh，ehh的表達； 3.MEF2A下調(diào)后導致后部體節(jié)凋亡增加； 4.

16、Hedgehog信號抑制MEF2A的表達； 5.利用表達譜基因芯片技術(shù)探討MEF2A基因下調(diào)后的基因表達改變， 為研究MEF2A下游的靶基因提供的源泉。 上述實驗證明MEF2A是斑馬魚后部體節(jié)發(fā)育所必需的 第四部分Wortmannin誘導斑馬魚“雙心畸形” 本論文第一、二部分我們證明BMP-2及MEF2A調(diào)節(jié)心臟收縮的功能，等報道磷脂酰肌醇激酶3(PI-3-K)可以負性調(diào)節(jié)離體培養(yǎng)心肌細

17、胞的收縮，我們想探討PI-3-K能否調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎心臟收縮，與BMP-2及MEF2A之間有無某種調(diào)節(jié)作用，我們用一種很常用的PI-3-K的抑制劑wortmannin誘導斑馬魚胚胎，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理的胚胎“雙心畸形”的表型，引起我們的關(guān)注。 本部分我們首次報道wortmannin誘導斑馬魚胚胎“雙心畸形”。首先用原位免疫熒光方法及整體原位雜交的方法證明wortmannin可誘導二個獨立的心臟，再次，證明wortmannin誘導斑馬魚