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文檔簡(jiǎn)介
1、前言
δ-catenin作為p120亞家族中的重要成員,與p120的結(jié)構(gòu)及作用相似,具有十個(gè)Arm重復(fù)序列,與p120同在細(xì)胞膜上的E-cadherin擁有共同的JMD(juxtamembrane domain)結(jié)合位點(diǎn),可以通過與E-cadherin(E-cad)直接結(jié)合形成E-cadherin/catenin復(fù)合體,調(diào)節(jié)細(xì)胞間的粘附。同樣,δ-catenin也可以入核并與kaiso相結(jié)合。
據(jù)報(bào)道,在神經(jīng)
2、元內(nèi),δ-catenin參與信號(hào)傳遞,還可以通過對(duì)SmallGTP酶(例如RhoA、Cdc42、Rac1)活性的調(diào)節(jié)來(lái)影響細(xì)胞骨架生長(zhǎng)。SmallGTP酶是Ras超家族中的小GTP結(jié)合蛋白,它們?cè)诖x中存在活化型(與GTP結(jié)合)和失活型(與GDP結(jié)合)兩種形態(tài),二者就像分子開關(guān)般動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)裝配actin細(xì)胞骨架,并引發(fā)細(xì)胞的形態(tài),趨化和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等不同的生物反應(yīng)。因此,我們推測(cè)在肺癌組織中,δ-catenin與SmallGTP酶之間很可能存
3、在著聯(lián)系。
在本研究中,我們對(duì)135例NSCLC樣本中δ-catenin及SmallGTP酶的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),并探討了它們的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系。同時(shí),在肺癌細(xì)胞系中分別過表達(dá)或干擾δ-catenin進(jìn)而影響肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
材料與方法
一、組織標(biāo)本與病人資料
135例具有隨訪資料的原發(fā)性肺鱗癌、腺癌(均來(lái)自1998~2005年在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的標(biāo)本
4、蠟塊)。其中71例男性,64例女性,平均年齡為58歲。根據(jù)WHO肺腫瘤組織學(xué)2004年分類標(biāo)準(zhǔn):其中鱗癌61例,腺癌74例。高分化32例,中分化64例,低分化39例。按照International Union AgainstCancer(UICC)于2002年修訂的腫瘤pTNM分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期22例,Ⅱ期46例,Ⅲ期59例,Ⅳ期8例。對(duì)這些病例中的70例進(jìn)行了術(shù)后隨訪,生存時(shí)間是從手術(shù)日期到由于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而死亡的日期(或木次隨訪日期)為止
5、。
此外,為提取蛋白及RNA,另取30例新鮮肺癌及癌旁正常肺組織。
二、免疫組織化學(xué)染色
對(duì)135例NSCLC標(biāo)本采用Streptavidin-Peroxidase(SP)免疫組織化學(xué)方法,檢測(cè)δ-catenin與SmallGTP酶的表達(dá)及其與各臨床病理因素之間的關(guān)系,及70例隨訪標(biāo)本中δ-catenin與SmallGTP酶的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。觀察δ-catenin在腫瘤組織的表達(dá),計(jì)數(shù)40
6、0個(gè)腫瘤細(xì)胞并計(jì)算其中陽(yáng)性染色細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。δ-catenin的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):免疫染色的強(qiáng)度(0=negative,1=weak,2=moderate,3=strong);免疫染色的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)(0=absent,1=1~25%,2=26~50%,3=51~75%,4=≥76%)。最終分?jǐn)?shù)即為兩項(xiàng)評(píng)分的乘積。為了便于統(tǒng)計(jì),將評(píng)分結(jié)果分為兩組:陰性表達(dá)<2;陽(yáng)性表達(dá)≥2。對(duì)SmallGTP酶進(jìn)行免疫組化檢測(cè),每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野,每
7、個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞,RhoA、Cdc42和Rac1胞漿表達(dá)(-)~(+)定義為表達(dá)正常,將(++)~(+++)定義為過度表達(dá)。將δ-catenin陽(yáng)性表達(dá)和smallGTP酶的過表達(dá)同時(shí)出現(xiàn)的情況,稱為協(xié)同表達(dá)。
三、細(xì)胞培養(yǎng),質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染
人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、SPC-A-1(Manassas,VA,USA),分別培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清,2.3g/L NaHC03、100U/ml青鏈霉素的RP
8、MI 1640或高糖DMEM(GBIC0Inc.,Los Angeles,CA,USA)培養(yǎng)液中。
(1)δ-catenin cDNA質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染:含人源性全長(zhǎng)δ-catenin cDNA的質(zhì)粒(pCMV5-FLAG/δ-catenin),用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(Invitrogen,USA)導(dǎo)入δ-catenin表達(dá)較低的SPC細(xì)胞系,并以空載體作為陰性對(duì)照。
(2)δ-cateni
9、n siRNA質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染:將設(shè)計(jì)的δ-catenin siRNA(5’-CUACGUUGACUUCUACUCAUU-3’;5’-UGAGUAGAAGUCAACGUAGUU-3’),利用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000導(dǎo)入δ-catenin表達(dá)較高的A549細(xì)胞系,同時(shí)以非特異性的亂序siRNA作為陰性對(duì)照。
四、Western Blotting與RT-PCR
應(yīng)用Western Blotting
10、與RT-PCR檢測(cè)肺癌及癌旁正常肺組織中δ-catenin與SmallGTP酶的蛋白和mRNA表達(dá)情況。
五、RhoA.Cdc42和Racl活性的檢測(cè)
在過表達(dá)或敲除δ-catenin肺癌細(xì)胞系中,通過Pull-Down和比色法測(cè)定small GTPases(RhoA、Cdc42、Rac1)活性的變化。
六、細(xì)胞侵襲能力的測(cè)定
通過基質(zhì)膠侵襲試驗(yàn)分別檢測(cè)過表達(dá)與敲除δ-cateni
11、n后的細(xì)胞侵襲能力。
結(jié)果
一、肺癌組織中,δ-catenin的陽(yáng)性表達(dá)與RhoA、Cdc42和Rao1的過表達(dá)有較好的一致性和相關(guān)性
在135例非小細(xì)胞肺癌病例中,δ-catenin陽(yáng)性表達(dá)為86例,陰性表達(dá)為49例,陽(yáng)性表達(dá)率為63.70%(86/135);RhoA、Cdc42和Rac1在肺癌組織中的表達(dá)明顯增強(qiáng),其過表達(dá)率分別為63.70%(86/135),67.41%(91/135)和6
12、5.19%(88/135)。并且它們的過表達(dá)與δ-catenin的陽(yáng)性表達(dá)具有較好的相關(guān)性(P<0.001;P<0.001;P<0.001)。分析這四種指標(biāo)同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)或過表達(dá)(協(xié)同表達(dá))與臨床病理因素的關(guān)系后發(fā)現(xiàn):肺腺癌中的協(xié)同表達(dá)率為52.70%(39/74),明顯高于于鱗癌的34.43%(21/61)(P<0.05);Ⅲ-Ⅳ期的協(xié)同表達(dá)率為58.21%(39/67),顯著高于Ⅰ-Ⅱ期的30.88%(21/68)(P<0.05)
13、;有LN轉(zhuǎn)移的病例協(xié)同表達(dá)率是52.75%(48/91),也明顯高于無(wú)LN轉(zhuǎn)移病例的27.27%(12/44)(P<0.05)。但研究中未發(fā)現(xiàn)協(xié)同表達(dá)與患者年齡、性別和分化程度有明顯關(guān)聯(lián)(P>0.05)。
二、δ-catenin的陽(yáng)性表達(dá)和RhoA、Cdc42和Rac1的過表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)
當(dāng)δ-catenin的陽(yáng)性表達(dá)和RhoA、Cdc42和Rac1過表達(dá)時(shí),患者的平均生存時(shí)間和5年生存率明顯低于它
14、們?cè)谡1磉_(dá)時(shí)患者的平均生存時(shí)間和5年生存率(P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.05,)。因而,δ-catenin的陽(yáng)性表達(dá)和RhoA、Cdc42和Rac1的過表達(dá)與患者的不良預(yù)后明顯相關(guān)。
三、與正常肺組織中相比,肺癌組織中δ-catenin和SmallGTP酶的表達(dá)明顯增強(qiáng)
RT-PCR結(jié)果顯示:δ-catenin、RhoA、Cdc42和Rac在癌旁正常肺組織中正常表達(dá),而在肺癌組織中表達(dá)
15、明顯增強(qiáng)。
Western Blot結(jié)果支持了我們?cè)赗T-PCR中結(jié)果,在肺癌組織中δ-catenin的表達(dá)明顯增強(qiáng),而RhoA,Cdc42和Rac1的表達(dá)也明顯增強(qiáng)。
四、過表達(dá)δ-catenin使RhoA活性降低的同時(shí)升高了Cdc42和Rac1的活性;而沉默δ-catenin后則產(chǎn)生相反的影響
我們分別檢測(cè)了過表達(dá)與沉默δ-catenin后RhoA、Cdc42、Rac1的活性變化。顯示在SP
16、C細(xì)胞系過表達(dá)δ-catenin后,總Cdc42和Rac1蛋白水平雖然沒有變化,但pull-down檢測(cè)顯示Cdc42/Rac1活性卻明顯增高(P<0.05),且G-LISA分析顯示RhoA活性明顯下降(P<0.001);在A549細(xì)胞系中沉默δ-catenin后,總Cdc42和Rac1蛋白雖然也沒變化,但GTP-Cdc42/Rac1卻顯著降低(P<0.05),RhoA活性增加(P<0.05)。
五、過表達(dá)δ-cateni
17、n促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲,而δ-catenin的下調(diào)則抑制侵襲
利用血清刺激的基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體外過表達(dá)或沉默δ-catenin后肺癌細(xì)胞侵襲能力的變化。過表達(dá)δ-catenin后,平均侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組;而在沉默δ-catenin后,平均侵襲的細(xì)胞數(shù)顯著低于相應(yīng)對(duì)照組。以上數(shù)據(jù)揭示了δ-catenin的上調(diào)可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲能力;而內(nèi)源性δ-catenin的下調(diào)則明顯抑制腫瘤細(xì)胞侵襲能力。
結(jié)論
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