Axin調(diào)控β-catenin的表達(dá)與肺癌的關(guān)系.pdf

1、β-連環(huán)素(β-catenin)既是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子，又是E-cadherin/catenin復(fù)合體中的重要成員。當(dāng)β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)蓄積時(shí)，能激活Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。Axin(Axisinhibitionprotein)是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)β-catenin磷酸化，促進(jìn)其降解。人類腫瘤中，這些重要分子的相關(guān)調(diào)控作用如何尚不清楚，分析其表達(dá)、探索其

2、調(diào)控機(jī)制對(duì)于防治人類肺癌意義重大。本研究探討Axin和β-catenin在肺癌中的表達(dá)和β-catenin突變情況，分析它們與各臨床病理因素的關(guān)系，揭示Axin調(diào)控β-catenin和誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。 方法： (1)本研究采用44例新鮮肺癌及癌旁正常肺組織標(biāo)本，均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床學(xué)院2003～2004年行外科切除手術(shù)的肺癌患者，患者術(shù)前均未接受過放化療。 提取組織蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白

3、定量。取等量蛋白，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉(zhuǎn)印，一抗(anti-Axin1∶50稀釋，Anti-β-actin1∶500稀釋)和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶50稀釋)孵育后DAB顯色。以β-actin為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算Axin的相對(duì)表達(dá)量。 使用Trizol試劑提取組織總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，均按說明書操作。PCR擴(kuò)增Axin，產(chǎn)物長度為452bp，產(chǎn)物使用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)觀察。以β-actin為內(nèi)對(duì)照，計(jì)

4、算Axin的相對(duì)表達(dá)量。 (2)100例肺鱗癌、腺癌及對(duì)應(yīng)的癌旁正常肺組織標(biāo)本來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床學(xué)院2001～2003年外科手術(shù)切除之原發(fā)性肺癌及癌周正常肺組織，患者術(shù)前均未接受過放化療。 標(biāo)本用中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4μm切片，經(jīng)脫蠟，脫苯，水化后，采用鏈菌素抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組化法(S-P法)檢測(cè)β-catenin蛋白和Axin蛋白表達(dá)，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以正常肺組織為陽

5、性對(duì)照。結(jié)果判定：β-catenin正常陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分比。無著色為陰性(-)，膜陽性瘤細(xì)胞數(shù)＞90％為表達(dá)正常，≤90％為表達(dá)降低。10％以上瘤細(xì)胞核和(或)漿染色為核或漿表達(dá)。表達(dá)降低和胞漿、胞核表達(dá)統(tǒng)歸為異常表達(dá)。Axin正常陽性表達(dá)定位于細(xì)胞漿，無著色和陽性瘤細(xì)胞數(shù)＜40％為陰性表達(dá)(-)，陽性瘤細(xì)胞數(shù)≥40％為陽性表達(dá)(+)。 采用酚-氯

6、仿-異戊醇法提取肺癌標(biāo)本DNA。PCR擴(kuò)增β-catenin基因第三外顯子，產(chǎn)物長度為199bp，經(jīng)8％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后與DNA標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物由上海聯(lián)合基因公司純化和測(cè)序。 (3)使用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃，含5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)肺癌PG細(xì)胞系。在35mm培養(yǎng)皿上接種2×105PG細(xì)胞，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞數(shù)達(dá)到90％-95％后，轉(zhuǎn)染Axin基因，按說明書操作

7、，以未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空載體的PG細(xì)胞為對(duì)照。 免疫熒光：分別于轉(zhuǎn)染后48h和72h取出轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組細(xì)胞爬片，丙酮固定10min。TritonX-100處理，血清封閉后，分別滴加FLAG、Axin、β-catenin和TCF-4一抗，4℃孵育過夜。避光加羅丹明(TRITC)和FITC標(biāo)記二抗，DAPI復(fù)染細(xì)胞核后，熒光顯微鏡觀察。 RT-PCR：收集轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組細(xì)胞，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別擴(kuò)增Axin、β-c

8、atenin和TCF-4，以β-actin為內(nèi)參。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，成像分析。 流式細(xì)胞術(shù)：收集轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組細(xì)胞，95％乙醇固定，將細(xì)胞密度調(diào)至1×106/ml，PI染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況，用ModfitLTV3.0軟件分析結(jié)果。 (4)使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： (1)44例新鮮肺癌組織中Axin蛋白的表達(dá)量

9、明顯低于正常肺組織(t=-2.819；P=0.007)。AxinmRNA的表達(dá)量也明顯低于癌旁正常肺組織(t=-2.513；P=0.016)。Axin的蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)：0.301；P=0.047)，但與肺癌的臨床病理特征之間未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性。(2)肺癌中β-catenin的異常表達(dá)率為80.0％，其中核表達(dá)陽性率為26.0％。高、中分化和低分化肺癌中，β-catenin的異常表達(dá)率分別為70.0％(35/50)和9

10、0.0％(45/50)，差異有顯著性(P=0.012)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌中β-catenin異常表達(dá)率分別為87.3％(48/55)和1.1％(32/45)，有明顯差異(P=0.044)。Axin的陽性表達(dá)率為48.0％，高、中分化和低分化肺癌中，Axin的陽性率分別為60.0％(30/50)和36.0％(18/50)，差異有顯著性(P=0.016)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期肺癌中，Axin的陽性率分別為46.3％(19/41)、76

11、.5％(13/17)和38.1％(16/42)，Ⅰ期和Ⅱ期(P=0.036)、Ⅱ期和Ⅲ期(P=0.008)均有顯著性差異。在β-catenin核表達(dá)陽性的病例中，Axin陽性表達(dá)率為15.4％(4/26)，顯著低于β-catenin核表達(dá)陰性的病例59.5％(44/74)(P＜0.001)。100例肺癌標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)β-catenin基因第三外顯子突變。 (3)將Axin基因?qū)敕伟㏄G細(xì)胞系后，Axin的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯

12、增加，蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核，β-catenin蛋白的表達(dá)明顯減少，但mRNA表達(dá)無明顯變化，同時(shí)TCF-4的蛋白和mRNA表達(dá)均明顯下降。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Axin基因后，PG細(xì)胞的凋亡率明顯增加，但細(xì)胞周期變化不明顯。 結(jié)論： (1)肺癌組織中Axin的表達(dá)量明顯低于正常肺組織。Axin的表達(dá)與肺鱗癌、腺癌的分期、低分化和β-catenin的細(xì)胞核蓄積負(fù)相關(guān)。Axin的表達(dá)增加能促進(jìn)β-catenin蛋白