山羊TYRP1基因和PMEL基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、酪氨酸相關(guān)蛋白1（tyrosinase related protein1，TYP1）基因和前黑素小體蛋白(premelanosome protein，PMEL)基因是調(diào)控動物毛色的主要候選基因，色彩多樣的毛色不僅能豐富人們的生活，其顏色的變化對自身的生長速度、對抗疾病的能力和生產(chǎn)性能有重要影響。啟動子作為基因表達(dá)調(diào)控的“指揮者”，不僅能決定轉(zhuǎn)錄起始，還能調(diào)控基因表達(dá)的強(qiáng)弱。本研究利用生物信息學(xué)、比較基因組學(xué)、分子克隆、雙酶切和雙熒光素酶

2、報告系統(tǒng)探究影響山羊黑色素形成的TYRP1和PMEL基因啟動子區(qū)域，通過點(diǎn)突變技術(shù)對核心啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進(jìn)行突變。結(jié)果對揭示山羊被毛顏色的分子遺傳機(jī)制具有重要作用。
　　本研究對山羊TYRP1基因和PMEL基因5'側(cè)翼序列為模板分別構(gòu)建不同長度的缺失報告基因載體，轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞和A375細(xì)胞，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，通過T檢驗驗證每個待測片段的啟動子活性，通過單因素方差分析比較不

3、同待測片段間的啟動子活性。
　　結(jié)果表明山羊TYRP1基因構(gòu)建的缺失重組載體與陰性對照相比無顯著差異，提示山羊TYRP1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之前的1405 bp不是啟動子區(qū)域;根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測和比較基因組學(xué)結(jié)果提示山羊PMEL基因在5'側(cè)翼序列可能存在4個啟動子候選區(qū)，對4個候選區(qū)域分別構(gòu)建缺失重組載體，293T細(xì)胞和A375細(xì)胞檢測結(jié)果表明-913/+76區(qū)域為啟動子區(qū)域，其中-251/+76為核心轉(zhuǎn)錄區(qū)，-251/-62區(qū)域的缺

4、失造成啟動子活性從最高到無，表明該區(qū)域?qū)ι窖騊MEL基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控有重要影響，對-251/-62區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，綜合多個軟件結(jié)果，提示在-206/-197、-186/-174、-151/-139、-91/-82和-82/-71存在NF-1、Sp1和CREB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。利用點(diǎn)突變技術(shù)對上述調(diào)控元件進(jìn)行突變、克隆和轉(zhuǎn)染，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測野生型及突變體在293T細(xì)胞和A375細(xì)胞內(nèi)的活性。結(jié)果提示NF-1(-20