人PNRC基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究.pdf

1、富含脯氨酸的核受體輔活化因子(proline-richnuclearreceptorcoactivator，PNRC)是最近克隆和鑒定的一種新的核受體輔活化因子，是以類固醇源性生長因子(steridogenticfactor1，SF1)作誘餌，利用酵母雙雜交系統(tǒng)從人乳腺cDNA表達文庫中篩選得到的。PNRC通過其位于C端的SH3(srchomology3)結(jié)合模體發(fā)揮核受體輔活化因子作用，能以配體依賴的方式與多種核受體相互作用，還能與孤

2、兒受體SF1和ERRa1以配體非依賴的方式相互作用。PNRC除了作為核受體的輔活化因子外，還通過SH3結(jié)合模體調(diào)節(jié)生長因子/Ras信號通路，競爭性抑制Ras蛋白的激活。PNRC在多種腫瘤組織及細胞中的表達明顯低于正常組織和細胞，這提示PNRC的轉(zhuǎn)錄抑制與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。 目前關(guān)于PNRC的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制尚不十分清楚，為了研究PNRC基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制及其轉(zhuǎn)錄抑制與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，我們進行了如下的研究：

3、 1.人PNRC基因轉(zhuǎn)錄起始位點的確定及啟動子的活性分析 采用5'端cDNA末端快速擴增法(rapidamplificationofcDNAends，RACE)確定了PNRC轉(zhuǎn)錄起始位點的堿基為G，該轉(zhuǎn)錄起始位點較報道的PNRCmRNA(NM006813)5'端第一個堿基提前了27bp。通過生物信息學(xué)預(yù)測軟件(http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl.)對

4、人PNRC基因的5'側(cè)翼區(qū)約2100bp的序列進行分析，預(yù)測5'側(cè)翼區(qū)內(nèi)具有啟動子功能的區(qū)域。應(yīng)用TransFacprofessional8.1(http://jupiter.coh.org/cgi-bin/transfac/bin/start.cgi)軟件對該區(qū)域進行分析，獲得可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。通過構(gòu)建包含PNRC基因5'上游序列的熒光素酶報告質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染，檢測熒光素酶活性，對PNRC啟動子區(qū)進行分析，結(jié)果顯示，啟動

5、子活性最小區(qū)域位于-123～+27，預(yù)測結(jié)果表明，在這一區(qū)域可能存在著NFY和RFX1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。 2.細胞內(nèi)、細胞外鑒定NFY和RFX1與PNRC基因啟動子活性區(qū)域的結(jié)合 染色質(zhì)免疫沉淀(chromatinimmunoprecipitationassay,CHIP)及電泳遷移率變動實驗(electrophoresismobilityshiftandsupershiftassay,EMSA)證明：NFY和RFX

6、1可在細胞內(nèi)、細胞外與PNRC啟動子區(qū)域相結(jié)合。 3.NFY和RFX1對PNRC基因啟動子活性的調(diào)控 NFY和RFX1真核表達質(zhì)粒與PNRC啟動子重組報告基因質(zhì)?；蚺c突變報告基因質(zhì)粒(含轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點突變)的共轉(zhuǎn)染實驗表明：NFY和RFX1通過與PNRC啟動子-123～+27區(qū)域結(jié)合，抑制PNRC啟動子的活性，RT-PCR和Westernblot證明：過表達NFY和RFX1可下調(diào)HepG2細胞中PNRC的表達。

7、 4.乳腺癌細胞中人PNRC基因啟動子CpG島甲基化狀態(tài)的研究 運用“MethPrimer”軟件對PNRC啟動子區(qū)進行分析，預(yù)測CpG島，通過硫化測序PCR(BisulfitesequencingPCR，BSP)，檢測PNRC啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀況，結(jié)果顯示：乳腺癌細胞中PNRC基因啟動子區(qū)存在CpG島的甲基化。 5.PNRC基因啟動子CpG島去甲基化對PNRC轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié) 將含PNRC啟動子序列

8、的報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞，細胞再經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR)處理后，檢測PNRC基因啟動子的活性；RT-PCR、Northem雜交、WesternBlot檢測乳腺癌細胞經(jīng)5-Aza-CdR處理后PNRC的表達情況。結(jié)果證明：PNRC基因啟動子CpG島去甲基化可增強PNRC啟動子活性并上調(diào)PNRC的表達。 本研究對人PNRC基因5'側(cè)翼區(qū)序列進行了

9、一系列缺失分析，確定了啟動子的最小活性區(qū)域-123～+27，并鑒定了與之相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子NFY和RFX1對PNRC啟動子的調(diào)節(jié)作用。此外，我們還從表觀遺傳學(xué)調(diào)控方面研究了PNRC基因啟動子CpG島的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞MCF-7中PNRC基因啟動子區(qū)存在CpG島的甲基化，對PNRC基因啟動子CpG島的去甲基化可增強PNRC啟動子活性并上調(diào)PNRC的表達，進一步證明了PNRC在乳腺癌細胞中的轉(zhuǎn)錄抑制與PNRC啟動子CpG島的甲基化相