叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子Foxp3重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、Foxp3是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子(Forkheadtranscriptionfactor)P亞家族的新成員。目前研究證實該基因特異性表達于固有CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞，并在該細胞的發(fā)育和功能維持中起重要作用，是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞特異性標志物之一，并作為轉(zhuǎn)錄抑制因子參與免疫應(yīng)答的調(diào)控。Foxp3包含叉頭狀結(jié)構(gòu)域、C2H2鋅指結(jié)構(gòu)及亮氨酸拉鏈等保守序列，在與靶基因啟動子和某些蛋白質(zhì)結(jié)合上起著重要作用。 近年來，人們通過構(gòu)

2、建Foxp3重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、Foxp3轉(zhuǎn)基因模型等方法對該基因的作用機制及臨床應(yīng)用展開了廣泛的研究。實驗發(fā)現(xiàn)Foxp3的異位表達在體外可誘導(dǎo)與固有CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表型及作用相似的調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生；誘導(dǎo)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性T細胞在體內(nèi)可直接或間接抑制效應(yīng)性T淋巴細胞、B淋巴細胞及某些抗原提呈細胞(如樹突狀細胞)等的增殖、分化和免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)體內(nèi)免疫耐受的產(chǎn)生，對治療某些自身免疫病及移植排斥反應(yīng)有一定效果；隨著研究的深入，該基因在腫

3、瘤免疫的作用也越來越受到關(guān)注，有文獻報道在某些腫瘤組織及周圍淋巴結(jié)等處發(fā)現(xiàn)Foxp3的表達，為腫瘤逃逸機制的研究以及新型靶向制劑的開發(fā)提供了新思路。 為更深入研究Foxp3的作用機制及誘導(dǎo)免疫耐受方面的應(yīng)用，本實驗利用AdEasyTMXL系統(tǒng)構(gòu)建攜帶Foxp3的重組腺病毒，并行初步鑒定。方法：從小鼠胸腺組織獲取約1.3kb大小的目的基因，克隆至穿梭載體pShuttle-IRES-hrGFP-1構(gòu)建重組穿梭載體；PmeⅠ線性化重組

4、穿梭質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化BJ5183-AD-1感受態(tài)細菌，以細菌內(nèi)同源重組方式完成腺病毒骨架與穿梭質(zhì)粒的同源重組，構(gòu)建攜帶Foxp3的重組腺病毒質(zhì)粒；經(jīng)人胚胎腎細胞(AD293)包裝后產(chǎn)生復(fù)制缺陷的重組腺病毒Ad-Foxp3。提取感染重組腺病毒的AD293細胞總RNA及總蛋白，以RT-PCR及WesternBlot檢測Foxp3mRNA和蛋白的表達。病毒擴增三代后，用半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(tissuecultureinfectiousdose50，

5、TCID50)方法測定重組腺病毒的滴度。最后，用HeLa細胞對野生型腺病毒進行檢測。結(jié)果：重組腺病毒Ad-Foxp3轉(zhuǎn)染AD293細胞3天后可觀察到綠色熒光蛋白(hrGFP)的表達，6～7天后，大部分細胞出現(xiàn)腫脹、脫落等細胞致病變效應(yīng)(CPE)；RT-PCR檢測表明Foxp3在AD293細胞可正確轉(zhuǎn)錄；WesternBlot檢測顯示Foxp3表達蛋白可與小鼠Foxp3IgG單克隆抗體特異性結(jié)合，而且分子量大小與預(yù)期一致；擴增三代后，病毒