Treg細(xì)胞中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3相互作用蛋白的鑒定與分析.pdf

1、目的：
　　隨著對新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群Treg研究的不斷深入，轉(zhuǎn)錄因子Foxp3對Treg細(xì)胞的分化及行使功能至關(guān)重要的作用也得到了證實(shí)。Treg在疾病中發(fā)揮調(diào)控作用取決于其關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)，而Foxp3又是這些關(guān)鍵效應(yīng)因子的轉(zhuǎn)錄因子，因此，研究Foxp3在Treg細(xì)胞中對關(guān)鍵效應(yīng)分子的表達(dá)意義重大。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子多與其他重要蛋白伙伴結(jié)合，以復(fù)合體的形式來行使功能。因此，在復(fù)合體層次研究轉(zhuǎn)錄因子更能真實(shí)反映機(jī)體內(nèi)情

2、況。本研究以串聯(lián)親和純化方法，從Tags knock-in小鼠的Treg細(xì)胞中分離并鑒定Foxp3的相互作用蛋白。本研究是開拓性研究，將填補(bǔ)國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域研究的空白，并為Foxp3相互作用蛋白功能的后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.轉(zhuǎn)基因小鼠建立
　　2.轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
　　2.1.鑒定GFP基因正確插入基因組
　　2.2.PCR鑒定KI小鼠基因組Neo基因通過Cre酶被敲除
　　2.3.PC

3、R鑒定KI小鼠Foxp3純合子
　　2.4.Foxp3基因mRNA表達(dá)鑒定
　　2.5.Foxp3融合標(biāo)簽的蛋白表達(dá)鑒定
　　3.流式細(xì)胞術(shù)分選Treg細(xì)胞
　　4.親和磁珠法分離純化Foxp3蛋白復(fù)合物
　　5.質(zhì)譜分析
　　6.免疫共沉淀鑒定
　　結(jié)果：
　　第一部分 Tags-IRES-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠建立與鑒定
　　Tags-IRES-GFP轉(zhuǎn)基因子代小鼠脾臟和淋巴結(jié)組織中提

4、取基因組DNA，用PCR方法鑒定了KI小鼠基因組中GFP基因及相關(guān)Tags片段均成功插入。KI小鼠與Cre+小鼠交配后產(chǎn)生的F1代仔鼠中，用Neo基因引物進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示仔鼠基因組中Neo基因被成功敲除。Neo基因被成功Cre掉的小鼠的子代基因組DNA，用針對插入片段Tags-IRES-GFP兩側(cè)序列的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定出Tags-IRES-GFP轉(zhuǎn)基因純合子小鼠。為了檢測Foxp3基因在WT C57 BL/6和Tags-

5、IRES-GFP轉(zhuǎn)基因純合子小鼠中表達(dá)是否有差異，我們對這兩種小鼠中Foxp3 mRNA進(jìn)行RT-PCR分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3 mRNA水平在兩種小鼠中無明顯差異，提示Tags-IRES-GFP外源基因的插入沒有影響小鼠Foxp3基因的表達(dá)。
　　第二部分 FACS分離Treg細(xì)胞
　　我們用淋巴細(xì)胞分離液分離Tags-IRES-GFP轉(zhuǎn)基因純合子小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞，再用FACS法分選并收集CD4+CD25+

6、GFP+Treg細(xì)胞。結(jié)果顯示，從KI小鼠中分選的CD4+CD25+GFP+Treg細(xì)胞回測后純度可達(dá)96.8％以上。對照細(xì)胞為FACS分選的野生型(WT C57 BL/6)小鼠CD4+CD25+T細(xì)胞，回測后純度可達(dá)99.3％。
　　第三部分 轉(zhuǎn)基因小鼠Treg細(xì)胞中Foxp3及Tags表達(dá)鑒定
　　我們進(jìn)一步對Tags-IRES-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠Treg細(xì)胞中Foxp3蛋白及其Tags標(biāo)簽是否正確表達(dá)進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步分

7、離Foxp3蛋白復(fù)合體提供依據(jù)。裂解Tags-IRES-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠CD4+CD25+GFP+Treg細(xì)胞和WT C57 BL/6小鼠CD4+CD25+T細(xì)胞提取總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析，鑒定Foxp3蛋白及其融合標(biāo)簽Myc、SBP、Protein G結(jié)合肽的表達(dá)。結(jié)果顯示，Myc、SBP和ProteinG結(jié)合肽的抗體分別在KI小鼠Treg細(xì)胞中檢測到一條特異的68kDa的目的條帶，與Foxp3(4

8、7kDa)-融合標(biāo)簽(21kDa)的理論值一致，而WT C57 BL/6小鼠T細(xì)胞中未檢測到此條帶，說明標(biāo)簽與Foxp3能正確融合表達(dá)。并且用IgG和SBP抗體從轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞裂解液pull down的產(chǎn)物中可明確檢測到Myc蛋白（Foxp3蛋白的一種標(biāo)簽），而從WT C57 BL/6小鼠中則檢測不到其表達(dá)，結(jié)果證實(shí)了各個標(biāo)簽可以正確融合表達(dá)。
　　第四部分 質(zhì)譜分析候選Foxp3相互作用蛋白
　　為了分析Foxp3的相互作

9、用蛋白，我們分別用IgG和SBP磁珠以及包被有Myc抗體的磁珠進(jìn)行親和純化。經(jīng)質(zhì)譜分析顯示Foxp3有60余種候選相互作用蛋白，包括Foxp1、Hdac2、Nfatc2、Cbfβ、Gata3等，驗(yàn)證了小鼠體內(nèi)Foxp3蛋白確實(shí)存在大量相互作用的伙伴蛋白。
　　第五部分 免疫共沉淀驗(yàn)證Foxp3相互作用蛋白
　　質(zhì)譜分析結(jié)果顯示Foxp3有大量候選相互作用蛋白，為了初步驗(yàn)證這些蛋白與Foxp3蛋白是否相互結(jié)合，我們裂解KI小鼠

10、CD4+CD25+GFP+ Treg細(xì)胞和WT C57BL/6小鼠CD4+CD25+T細(xì)胞，上清用各種標(biāo)簽或候選靶蛋白抗體包被的磁珠結(jié)合，磁珠分離法獲得復(fù)合物，然后進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示，用包被有Hdac2抗體、Cbfβ抗體以及Myc抗體的磁珠pull down KI小鼠和WT C57 BL/6小鼠Treg細(xì)胞裂解液后，分別能檢測到Cbfβ(21kDa)、NFATC2(120kDa)、Gata3(50kDa)和Fox

11、p1(90kDa)以及融合Myc標(biāo)簽的Foxp3(68kDa)蛋白。這些初步結(jié)果提示質(zhì)譜鑒定的Foxp3與其候選相互作用蛋白之間確實(shí)相互結(jié)合，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)了基礎(chǔ)。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立了Tags-IRES-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠。我們分別PCR方法鑒定了轉(zhuǎn)基因小鼠Tags標(biāo)簽成功插入;轉(zhuǎn)基因小鼠的Neo基因通過Cre酶被成功敲除;建立了KI小鼠純合子;而且Foxp3基因及其融合標(biāo)簽均能正確表達(dá)。
　　2.FAC

12、S成功分選出高純度的CD4+CD25+GFP+Treg細(xì)胞。流式細(xì)胞分選的Treg純度超過96.8％，并用Western Blot方法證實(shí)了Tags標(biāo)簽在Treg細(xì)胞中能夠穩(wěn)定表達(dá)。
　　3.親和磁珠純化法獲得了Foxp3蛋白復(fù)合物，通過質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫搜索找到60余種Foxp3候選相互作用蛋白。
　　4.免疫共沉淀法初步鑒定了部分Foxp3潛在相互作用蛋白。我們用免疫親和磁珠法進(jìn)行免疫共沉淀，初步證實(shí)了Nfatc2、Gat

13、a3、Hdac2、Cbfβ和Foxp3在Treg中有相互作用關(guān)系。
　　綜上所述，我們成功構(gòu)建了Tags-IRES-GFP轉(zhuǎn)基因(knock-in，KI)小鼠，并用Western blot、RT-PCR進(jìn)一步鑒定了Tags標(biāo)簽和融合蛋白以及Foxp3基因mRNA的成功表達(dá)。通過質(zhì)譜分析顯示，F(xiàn)oxp3有許多相互作用蛋白，用Foxp3蛋白的標(biāo)簽Myc和潛在伙伴蛋白的抗體進(jìn)行免疫共沉淀證實(shí)了Foxp3與Nfatc2、Gata3、Fox