脫細(xì)胞真皮在眼瞼再造中的應(yīng)用研究.pdf

1、脫細(xì)胞真皮是經(jīng)過特殊的處理方法使皮膚中主要引起免疫反應(yīng)的細(xì)胞成分脫去，留下基底膜和真皮中的膠原基質(zhì)。膠原的特殊結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)上的優(yōu)勢(shì)使膠原在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著十分廣闊的應(yīng)用前景。脫細(xì)胞真皮膠原的這種優(yōu)勢(shì)來源于它獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、生化及生物學(xué)性質(zhì)。主要特點(diǎn)有：(1)低免疫原性，(2)膠原材料與宿主細(xì)胞及組織之間良好的相互作用，(3)膠原對(duì)血小板具有凝聚作用，可形成血栓阻止流血，(4)天然膠原纖維的有序纖維狀結(jié)構(gòu)，(5)膠原是為結(jié)締組織提供強(qiáng)度的主要

2、蛋白成分，因而可以在廣泛范圍內(nèi)滿足機(jī)體對(duì)機(jī)械強(qiáng)度的要求。此外，膠原蛋白中還含有豐富的甘氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸，其水解產(chǎn)物中還存在有生理活性肽等等。目前，以脫細(xì)胞真皮為主的細(xì)胞外基質(zhì)已在眼整形手術(shù)中得到了較為廣泛的應(yīng)用。但在臨床研究中發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞真皮在植入體內(nèi)后仍有一定程度的收縮，另外傳統(tǒng)的瞼板替代材料如異體鞏膜植入體內(nèi)后降解速度較快的原因國(guó)內(nèi)未有明確的解釋。因此本研究探索了將皮膚制備成脫細(xì)胞基質(zhì)的方法，對(duì)真皮膠原蛋白的不同的化學(xué)交聯(lián)方法，

3、找出最適的交聯(lián)條件，如pH值、濃度及所用溶劑等要素，以交聯(lián)后的膠原片的熱收縮轉(zhuǎn)變溫度，降解時(shí)間和質(zhì)量損失為指標(biāo)進(jìn)行觀察。從免疫學(xué)方面分析植入兔眼瞼后脫細(xì)胞真皮和異體鞏膜的轉(zhuǎn)歸，同時(shí)在臨床上觀察了脫細(xì)胞真皮在眼瞼修復(fù)中的效果。 第一部分同種異體人脫細(xì)胞真皮的制備、保存與鑒定 目的:以不同方法制備脫細(xì)胞真皮，比較不同方法、濃度、作用時(shí)間對(duì)皮膚脫細(xì)胞效果的差異，找到適合眼瞼再造的皮膚脫細(xì)胞方法。 方法: 將取自

4、病原體篩查的人尸體皮膚用鼓式取皮機(jī)反取法切下帶部分真皮組織的皮膚，經(jīng)0.01mmol/LTris-HCI緩沖液振蕩后分別用0.5％(A)、1.0％(B)、2.0％(C)、4.0％(D)的TrintonX-100溶液脫去細(xì)胞，然后將組織胃于0.1％SDS溶液中振蕩24小時(shí)并再將其按序放入200μg/mlDNA酶和20μg/mlRNA酶溶液中，于常溫條件下分別振蕩2h。另一組為將剪切好的皮膚分別置于含有0.25％的胰蛋白酶(Trypsin)

5、0.37％EDTA溶液中24(E)或48小時(shí)(F)，再將其按序放入200μg/mlDNA酶和20μg/mlRNA酶溶液中，于常溫條件下分別振蕩2h。制成的材料凍干并經(jīng)γ射線消毒保存。鑒定方法包括常規(guī)HE染色，透射電鏡(transmissionelectronmicroscopy,TEM)檢查，細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)。 結(jié)論:以TrintonX-100處理的脫細(xì)胞真皮結(jié)構(gòu)緊湊，膠原纖維保存完好，其中2％TrintonX-100處理的材料組織

6、殘留細(xì)胞少，是一種適合在眼瞼再造中代替瞼板材料的皮膚脫細(xì)胞處理的方法。 第二部分脫細(xì)胞真皮膠原體外交聯(lián)的初步研究 目的:研究碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞氨(NHS)對(duì)脫細(xì)胞真皮膠原的交聯(lián)效果，找出最適合的交聯(lián)條件。 方法: 將未交聯(lián)的脫細(xì)胞真皮分別放入EDC對(duì)COOH的摩爾比分別設(shè)定在5:1，4:1，3:1，2:1，1:1的EDC和EDC與NHS混和的溶液中，同時(shí)對(duì)溶液設(shè)置不同的pH值，金屬離子

7、，反應(yīng)時(shí)間等參數(shù)。以樣品收縮轉(zhuǎn)變溫度，掃描電鏡組織學(xué)檢查，材料含水量分析，樣品力學(xué)性能，體外膠原酶消化溶解試驗(yàn)來測(cè)定脫細(xì)胞真皮的交聯(lián)程度。 結(jié)論: EDC和NHS的聯(lián)合作用提高了對(duì)脫細(xì)胞真皮膠原的交聯(lián)速率和交聯(lián)程度，同時(shí)交聯(lián)的材料有較好的柔韌性。體外試驗(yàn)表明在酶降解過程中可保留較高的抗張強(qiáng)度。 第三部分脫細(xì)胞真皮和異體鞏膜在兔眼瞼重建模型中的實(shí)驗(yàn)觀察 目的:探討脫細(xì)胞真皮和異體鞏膜在修補(bǔ)兔眼瞼瞼板缺損中的

8、轉(zhuǎn)歸過程和組織相容性。 方法: 取體重約2.5Kg的新西蘭白兔16只，隨機(jī)分成兩組，在兔右下瞼中央切除瞼板約10×4mm，缺損區(qū)植入保存的兔脫細(xì)胞真皮和異體鞏膜，術(shù)后觀察植入?yún)^(qū)域的炎癥反應(yīng)，瞼結(jié)膜能否在植入物表面生長(zhǎng)，觀察兩種材料的成形性能。分別于術(shù)后1周，4周，8周及12周取出標(biāo)本，作組織學(xué)及免疫組化檢查。血液學(xué)檢查觀察抗體和CD4,CD8細(xì)胞的變化。 結(jié)論: 脫細(xì)胞真皮是一種較好的瞼板組織替代物，具有

9、一定的柔韌性，可任意剪裁，引起的免疫反應(yīng)輕微，作為一種細(xì)胞外基質(zhì)，可引導(dǎo)自身組織的膠原纖維長(zhǎng)入。而異體鞏膜植入后較快吸收的原因可能是由于存在較強(qiáng)的免疫和炎癥反應(yīng)。 第四部分脫細(xì)胞真皮在眼瞼臨床修復(fù)技術(shù)中的初步探討 一、脫細(xì)胞真皮在眼瞼原位重建術(shù)中的臨床觀察 目的:探討脫細(xì)胞真皮作為瞼板替代物在眼瞼重建術(shù)中的臨床效果方法1.研究對(duì)象：不同原因?qū)е碌难鄄€缺損29例31只眼瞼，男性19例，女性10例，年齡從12歲到47

10、歲，平均32歲?；瘜W(xué)燒傷19例，熱燒傷8例，機(jī)械傷1例，先天性畸形1例。 2.手術(shù)方法: 離瞼緣3mm平行全長(zhǎng)切開皮膚，分離眼輪匝肌，將殘留的瞼板連帶瞼結(jié)膜中央剖開，分離穹隆部結(jié)膜使其松解，如有較多結(jié)膜缺損則在中間縫合一塊羊膜或唇粘膜，將制作的脫細(xì)胞真皮浸入帶抗生素的生理鹽水中5分鐘，基底膜面朝向眼球表面縫合于下方殘留的瞼板，修復(fù)上瞼時(shí)將脫細(xì)胞真皮上緣與提上瞼肌斷端縫合，兩側(cè)與內(nèi)外眥韌帶縫合，然后將分離的眼輪匝肌覆蓋于供

11、體表面，如合并有眼瞼前層皮膚缺損，則用游離的中厚皮瓣作荷包式縫合。 結(jié)果: 隨訪5-25個(gè)月，平均14個(gè)月。31只眼瞼中，治愈18只瞼(58％)，顯效10只瞼(32％)，改善3只瞼(10％)，無手術(shù)失敗者，以先天性眼瞼缺損，機(jī)械傷及輕度眼瞼燒傷的效果較好。 結(jié)論: 脫細(xì)胞真皮材料容易獲得，避免了第二手術(shù)切口及縮短手術(shù)時(shí)間，經(jīng)硬化處理的脫細(xì)胞真皮復(fù)水后具有較好的可塑性和彈性，另外光滑的基底膜面可使結(jié)膜上皮化

12、快速進(jìn)行。由于脫去了細(xì)胞成分，不僅引起的免疫反應(yīng)很輕微，也大大減少了病毒寄宿的環(huán)境。在我們所做的短期臨床觀察中，脫細(xì)胞真皮可基本起到支撐眼瞼后層的支架作用。 二、脫細(xì)胞真皮在疤痕性瞼內(nèi)翻中的臨床觀察 目的:探討脫細(xì)胞真皮在疤痕性瞼內(nèi)翻中的治療效果方法1.研究對(duì)象：不同原因?qū)е碌陌毯坌圆€內(nèi)翻患者42例，其中男性24例，女性18例，年齡從11歲至68歲，平均年齡為36歲。其中熱燒傷患者12例，化學(xué)傷患者20例，沙眼導(dǎo)致的疤痕

13、性瞼內(nèi)翻10例。 2.手術(shù)方法：上瞼的疤痕性矯正術(shù)為距瞼緣3mm平行瞼緣全長(zhǎng)切開皮膚，向下分離瞼板前的眼輪匝肌，充分暴露疤痕化的瞼板組織。用刀片在瞼板水平中線兩側(cè)各作-45°角的切口，尖端向結(jié)膜，底寬2～3衄，長(zhǎng)度為瞼板全長(zhǎng)。用6-0可吸收線間斷縫合瞼板切口4～5針，用5-0絲線由皮膚切口下緣1mm處進(jìn)針，出針后水平經(jīng)過瞼板切口上緣，由皮膚切口上緣出針，一般縫合5～7針。然后用用瞼板夾或較大的霰粒腫央，將手術(shù)部位的瞼緣夾緊固定，

14、沿緣間灰線切開，其長(zhǎng)度應(yīng)略較倒睫范圍較長(zhǎng)，必須將所有的倒睫包括在內(nèi)。先用尖刀片垂直切開緣間部灰線深約0.5～1.0mm，然后細(xì)心向深部分離，在灰線處將眼瞼剖開為前后兩層，深度約2～3mm。此時(shí)將脫細(xì)胞真皮切成底部寬為1mm的楔形條狀物嵌入切開的瞼緣前后唇之間。楔形脫細(xì)胞真皮底部形成新的瞼緣，如果切口長(zhǎng)度超過1cm，緣間切口應(yīng)使用10-0尼龍線連續(xù)縫合以固定充填物。植入脫細(xì)胞真皮時(shí)不宜過深或過淺，過深則緣間切口張開效果較差，或切口很快重新

15、愈合；過淺則植入物突出緣間部易脫落或引起眼部不適感。植入充填物底部應(yīng)與緣問部處于同一水平為宜。術(shù)畢于眼部涂抗生素眼膏，約于術(shù)后10天可拆除10-0尼龍線。 結(jié)果: 隨訪期限為5個(gè)月至23個(gè)月，平均隨訪時(shí)間為9個(gè)月。在隨訪期間，按手術(shù)成功標(biāo)準(zhǔn)有74只眼瞼恢復(fù)了正常的解剖位置，另外10例未達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，成功率為88％。失敗的原因部分為由于需緊急保護(hù)角膜而在炎癥期施行的手術(shù)，另外一個(gè)重要原因是失敗的病例全部是重型的疤痕性瞼內(nèi)翻