硒對于氧化損傷大鼠肝細胞糖代謝關鍵酶的影響及其機制的研究.pdf

1、目的： 研究硒對于氧化損傷肝細胞糖代謝關鍵酶表達的影響，為進一步研究硒改善糖尿病糖代謝紊亂的分子機制提供實驗依據。 方法： 1.氧化損傷細胞模型的建立及鑒定：采用不同濃度的H2O2(0.05、0.1、0.2、0.5、1mmol/L)誘導正常大鼠肝細胞(BRL)建立了氧化損傷的細胞模型，并通過細胞形態(tài)學觀察、MTT實驗和抗氧化指標檢測進行模型鑒定。 2.硒對細胞氧化損傷的保護作用研究：細胞分為5組，正常對照

2、組、損傷模型組(H2O2濃度為0.1mmol/L)、損傷+低劑量補硒組(Se-L組)、損傷+中劑量補硒組(Se-M組)、損傷+高劑量補硒組(Se-H組)，其中Na2SeO3終濃度分別為0.05、0.1和1μmol/L。通過測定細胞活力測定、抗氧化指標和細胞凋亡率研究硒對氧化損傷細胞的保護作用，并通過實時定量PCR技術檢測細胞GSH-Px的mRNA的表達水平探討其作用機制。 3.硒對于氧化損傷肝細胞糖代謝酶的影響：細胞分組同前，采

3、用實時定量PCR技術測定細胞糖代謝、胰島素信號通路和細胞凋亡通路中關鍵蛋白葡萄糖激酶(glucokinase，GK)、糖原合成酶(glycogen synthase，GS)、蛋白激酶B(proteinkinase B，PKB/Akt)和凋亡信號調節(jié)激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1)的mRNA表達情況；采用酶聯免疫法(ELISA)檢測細胞中GK、糖原合成酶激酶3(glycogen

4、synthase kinase-3，GSK-3)蛋白表達水平；并通過Western blot檢測胰島素和細胞凋亡信號通路蛋白Akt和ASK1的表達情況。 結果： 1.體外BRL氧化損傷模型的建立：形態(tài)學觀察結果顯示，與正常對照組相比，0.05～0.2mmol/LH2O2損傷組細胞變形，但細胞邊界尚清楚，0.5和1mmol/LH2O2損傷組細胞明顯變形，胞膜邊緣不清晰，有較多細胞脫落。H2O2氧化損傷組細胞活力MTT(OD

5、)降低，與正常對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且隨著H2O2濃度升高，MTT有降低趨勢。氧化損傷組細胞谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和超氧化物歧化酶I(superoxide dismutase，SOD)活性降低，丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)含量升高，與正常對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 2.補硒對體外氧化損傷肝細胞的保護作用：

6、倒置相差顯微鏡觀察，損傷組細胞變形，細胞間隙增大，Se-L組與損傷組相比，細胞形態(tài)稍有改善，細胞間隙縮小，細胞間連接增加；Se-M和Se-H組與損傷組相比，細胞間隙明顯縮小，形態(tài)基本恢復正常。補硒組細胞MTT(OD)值、GSH-Px和SOD活性高于H2O2損傷模型組，MDA含量和細胞凋亡率低于損傷模型組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。補硒組細胞GSH-Px的mRNA表達水平高于損傷模型組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

7、3.硒對于氧化損傷肝細胞糖代謝酶的影響：損傷模型組細胞GK的mRNA和蛋白表達水平低于正常對照組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，補硒組GK的mRNA和蛋白表達水平高于損傷組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。損傷模型組細胞Akt的mRNA和蛋白表達水平低于正常對照組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，補硒組Akt的mRNA和蛋白表達水平高于損傷組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。損傷模型組GSK-3蛋白表達水平低于正常對照組，差別

8、有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，補硒組GSK-3蛋白表達水平與損傷組相比，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。損傷模型組GS的mRNA表達水平低于正常對照組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，補硒組細胞GS的mRNA表達水平高于損傷組差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。損傷模型組細胞ASK1的mRNA和蛋白表達水平高于正常對照組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，補硒組細胞ASK1的mRNA和蛋白表達水平低于損傷模型組，差別有統(tǒng)計學意義(P<

9、0.05)。 結論： 1.本研究采用不同濃度的H2O2誘導正常大鼠肝細胞(BRL)建立了氧化損傷的細胞模型，并通過細胞形態(tài)學觀察、MTT實驗和抗氧化指標的檢測進行模型鑒定，確定了0.1mmol/L的H2O2為適合實驗研究的損傷濃度。 2.觀察不同濃度的硒對氧化損傷的肝細胞模型的糖代謝關鍵酶GK、GS、GSK-3的影響。結果顯示，硒可以上調氧化損傷肝細胞GK的mRNA和蛋白表達水平，同時可以上調GSmRNA的表達水

10、平，提示硒可以在一定程度上改善氧化損傷對肝細胞糖代謝關鍵酶的影響。其可能的機制如下： 1.抗氧化途徑：硒通過提高氧化損傷肝細胞的SOD活力、增加細胞GSH-Px的mRNA表達水平和酶活性、降低細胞中MDA含量等作用，對氧化損傷的肝細胞起到一定的保護作用。 2.PI3K-Akt-GSK3途徑：硒通過提高胰島素信號傳導通路(PI3K-Akt-GSK3)中關鍵信號分子Akt的mRNA和蛋白表達的水平，進而促進了胰島素的信號傳導