肝細(xì)胞癌N-糖鏈的結(jié)構(gòu)改變及其機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一,其病情進(jìn)展快、預(yù)后差,因早期診斷困難、治療手段有限而死亡率高。因此,研究其發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ),尋找HCC早期診斷生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn),對HCC的診斷和治療具有重要意義。
　　糖蛋白糖鏈參與細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫監(jiān)視,維持著多細(xì)胞生物體各項(xiàng)有序性生命活動(dòng)。糖鏈的異常改變通常與多種疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。對惡性腫瘤特異性糖鏈結(jié)構(gòu)與功能的研究不僅可以揭示糖鏈的生物學(xué)功能,還能為

2、腫瘤生物標(biāo)志物的篩選和新藥靶點(diǎn)的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。DSA-FACE技術(shù)是本世紀(jì)初新興的糖生物學(xué)檢測技術(shù),因其高通量、高靈敏度的特點(diǎn),目前已在腫瘤血清生物標(biāo)志物研究中得到足夠認(rèn)識(shí),但利用該技術(shù)對非血清樣本的研究則少有報(bào)道。
　　本文從糖生物學(xué)角度、利用DSA-FACE技術(shù)對HCC特異性N-糖鏈結(jié)構(gòu)及其發(fā)生異常改變的分子機(jī)理進(jìn)行研究,以期為HCC的早期診斷、惡性演進(jìn)和轉(zhuǎn)移預(yù)測提供生物標(biāo)志物,為HCC靶向治療靶點(diǎn)選擇及基于糖鏈結(jié)構(gòu)改變的惡性

3、轉(zhuǎn)化機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。在研究中,首先優(yōu)化了血清糖蛋白N-糖組DSA-FACE檢測技術(shù),有效提高了其檢測效率。在此基礎(chǔ)上,建立了可用于體外培養(yǎng)細(xì)胞系及臨床組織樣本細(xì)胞表面N-糖組分析技術(shù),通過分析膜蛋白不同制備方法(去污劑法和超速離心法),并引入石墨化炭黑(GC)樹脂純化技術(shù)、優(yōu)化研究體系,使得該技術(shù)對于細(xì)胞表面N-糖組的檢測更加靈敏、可靠,并具有良好的可重復(fù)性,從而拓展了DSA-FACE技術(shù)的應(yīng)用范圍,突破了以往只用于檢測血清樣本N-糖

4、組的局限性。
　　在優(yōu)化N-糖鏈檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上,本文分析了北方地區(qū)190例HCC患者血清樣本,以110例乙肝病毒感染者及179例健康人血清樣本作為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn),由血清中三個(gè)發(fā)生異常變化的N-糖鏈NGA2F、NGA2FB和NA3聯(lián)合獲得的Log[(NGA2F+NGA2FB)/NA3]指標(biāo)對于HCC的診斷準(zhǔn)確性可達(dá)85％,診斷靈敏度和特異性分別可達(dá)到71.1%和86.0%,且該指標(biāo)的診斷準(zhǔn)確性不受患者性別、年齡、腫瘤病理分期、癌細(xì)

5、胞分化程度等因素影響。深入分析本研究中40例AFP處于正常值范圍(AFP<20ng/mL)的HCC患者血清,結(jié)果顯示有23例血清中Log[(NGA2F+NGA2FB)/NA3]指標(biāo)明顯高于閾值(0.1045),證明該指標(biāo)可有效降低AFP對于HCC的漏診率。進(jìn)一步利用Logistic回歸分析法建立基于血清特異性糖鏈(NGA2F、NGA2FB、NA3)與AFP的聯(lián)合診斷模型,ROC曲線分析表明,聯(lián)合診斷模型對于HCC的診斷準(zhǔn)確性可達(dá)到94.

6、8%。該結(jié)果證實(shí),以血清N-糖鏈生物標(biāo)志物為基礎(chǔ)的聯(lián)合診斷模型可作為我國北方地區(qū)HCC特異性的普查生物標(biāo)志物。
　　利用本文建立的細(xì)胞表面N-糖組DSA-FACE技術(shù)完成88對臨床HCC組織樣本細(xì)胞表面N-糖組分析。結(jié)果表明,與癌旁對照組相比,峰L10(NA3FB)在HCC細(xì)胞表面顯著性增加(p<0.0001),而峰L6(M8)在HCC細(xì)胞表面顯著性降低(p<0.0001)。這兩個(gè)N-糖鏈在不同性別、年齡及癌細(xì)胞分化程度的患者中均

7、表現(xiàn)出顯著性改變,并于HCC發(fā)病早期就具有明顯改變的趨勢。此外,通過與具有不同組織來源及性別差異的100對乳腺癌組織細(xì)胞表面N-糖組的比較,NA3FB在兩種不同的腫瘤細(xì)胞表面均具有顯著性增高趨勢,而NA2和M8的差異表達(dá)則具有明顯的組織特異性。進(jìn)一步通過分析61例HCC患者的臨床組織樣本及相應(yīng)的血清樣本N-糖組,發(fā)現(xiàn),NA3FB不僅在HCC細(xì)胞表面顯著性增高(p<0.0001),而且在相應(yīng)患者血清中的含量也顯著增高(p<0.0001)。

8、這表明,HCC駐留型及分泌型糖蛋白NA3FB糖鏈修飾異常增多可能與HCC的發(fā)病機(jī)制具有相關(guān)性。
　　為探討NA3FB顯著增加的分子機(jī)理,本文對能夠合成NA3FB的五種糖基轉(zhuǎn)移酶(Fut8、GalT-1、GnT-V、GnT-IVa、GnT-IVb)在HCC臨床組織中的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,與相應(yīng)癌旁組織相比,腫瘤組織中只有GnT-IVamRNA及蛋白的表達(dá)水平具有增高趨勢。利用RNAi技術(shù)減低mgat4a表達(dá)48h后,檢測HCC

9、細(xì)胞系HepG2細(xì)胞表面NA3FB的表達(dá)水平。結(jié)果表明,與陰性對照相比,基因沉默組細(xì)胞表面NA3FB顯著減少。這說明NA3FB的減少與糖基轉(zhuǎn)移酶GnT-IVa的基因沉默直接相關(guān)。因此,該結(jié)果證實(shí)HCC細(xì)胞中GnT-IVa的異常高表達(dá)與細(xì)胞表面及血清中NA3FB異常增加密切相關(guān)。
　　綜上所述,本文通過分析膜蛋白制備方法及引入GC樹脂純化方法,建立了適合于不同臨床樣本N-糖鏈的DSA-FACE檢測技術(shù),獲得了適用于中國北方地區(qū)HCC