中國對蝦（Penaeus chinensis）孵化酶的分離純化、性質(zhì)及其鑒定研究.pdf

1、在早期胚胎發(fā)育過程中，許多種動物的胚胎周圍都包被有一層保護(hù)性外膜，稱之為卵殼。發(fā)育到特定階段后，胚胎必須從這層膜的包圍中解脫出來，才能進(jìn)一步生長和發(fā)育，這種脫出稱為孵化。孵化酶(眥)是由動物早期孵化胚胎中孵化腺細(xì)胞特異性分泌的、在孵化過程中起關(guān)鍵作用的一種蛋白酶，它是研究早期胚胎發(fā)育過程中特定階段特定蛋白質(zhì)的基因表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制的一個(gè)理想分子模型，查清孵化酶的性質(zhì)對于研究動物的孵化機(jī)制以及動物孵化率的控制技術(shù)具有重要的理論意義。目前，對

2、動物孵化酶的研究主要集中在兩棲類和魚類動物中，對對蝦孵化酶的研究極少。為了查清中國對蝦孵化酶的性質(zhì)，本文首次利用凝膠過濾和離子交換柱層析對中國對蝦孵化酶進(jìn)行了分離純化，并以酪蛋白和孵化酶特異性底物卵膜對其生化性質(zhì)和酶性質(zhì)進(jìn)行了研究，進(jìn)而用免疫組化和電鏡技術(shù)對孵化前后胚胎中的孵化酶和分泌細(xì)胞進(jìn)行了初步鑒定。 本文利用67％硫酸銨沉淀、Sephacryl凝膠過濾柱層析和 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層

3、析，經(jīng)過卵膜降解活性鑒定，從中國對蝦胚胎孵化液中成功純化出了中國對蝦孵化酶，所得純化樣品的得率為44.29％，純化倍率為48.05，其在SDS-PAGE電泳中的分子量約為43 kD，該酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，最適反應(yīng)pH值為6.0，其對酪蛋白降解活性的Km值為7.47 mg/ml。抑制劑對其酶活性的影響結(jié)果顯示，該孵化酶的活性幾乎可被SBTI、p-APMSF、Bestatin和NEM所完全抑制，被ovomucoid、 TLCK、IAM

4、、chymostatin和PMSF所強(qiáng)烈抑制，而對pepstatin A、TPCK、 LBTI和leupeptin不敏感，表明該酶極可能是一種屬于胰蛋白酶類型的絲氨酸蛋白酶。EDTA、DETC和幾種金屬離子對該酶活性的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該酶對EDTA、DETC、Zn<'2+>、 ca<'2+>、 Mg<'2+>和Cu<'2+>非常敏感，表明該孵化酶有可能是一種金屬蛋白酶。金屬離子的活性回復(fù)結(jié)果顯示，為EDTA所抑制的孵化酶活性幾乎可被10m

5、mol/l Zn<'2+>完全回復(fù)，進(jìn)一步證明中國對蝦孵化酶很可能是一種Zn-金屬蛋白酶。為了驗(yàn)證從中國對蝦胚胎孵化液中分離純化孵化酶的實(shí)驗(yàn)方案以及所得酶為中國對蝦孵化酶，本文利用免疫組化和電鏡技術(shù)對中國對蝦孵化酶在孵化期胚胎中的出現(xiàn)情況及分泌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在中國對蝦孵化期胚胎中，出現(xiàn)了大量的孵化酶；透射電鏡研究結(jié)果顯示，在中國對蝦孵化期胚胎中，出現(xiàn)了含有大量酶原顆粒的孵化腺細(xì)胞；說明中國對蝦胚胎在