四氫嘧啶類化合物Zl-5015的免疫抑制作用及其作用機制研究.pdf

1、目的:新型四氫嘧啶類化合物ZL-5015（1，3-二環(huán)戊基-1，2，3，6-四氫嘧啶-4，5-二甲酸二乙酯）兼具抗炎和免疫抑制活性，本研究采用體內(nèi)和體外實驗?zāi)Ｐ吞接慫L-5015的免疫抑制作用特點及作用機制，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)改造及深入的作用機制研究提供參考信息。
　　 研究內(nèi)容:
　　 1.ZL-5015對正常小鼠免疫功能的影響
　　 1.1對體液免疫功能的影響---兔紅細胞免疫小鼠產(chǎn)生血清溶血素(IgM)模型

2、>　　 1.1.1材料與方法BALB/c小鼠50只，隨機分為5組，各組動物均連續(xù)7天給藥，給藥后第2天上午，每只鼠腹腔注射20％(V/V)的兔紅細胞生理鹽水0.2 ml進行免疫，同日下午繼續(xù)給藥，免疫后第6天（免疫當天為第0天），動物摘眼球取血，分光光度法檢測各組小鼠血清中的溶血素水平。
　　 1.1.2結(jié)果ZL-5015高、中劑量組(200、100 mg/kg.b.w)能明顯抑制小鼠血清溶血素水平，抑制率分別為32.8％和2

3、0.0％(P=0.000，P=0.000)，ZL-5015低劑量組(50 mg/kg.b.w)能輕微抑制小鼠血清溶血素水平，但與溶媒對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 1.2對細胞免疫功能的影響---二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)模型
　　 1.2.1材料與方法BALB/c小鼠50只，隨機分為5組，給藥第一天用1％DNFB致敏小鼠，連續(xù)給藥7天，于致敏后第7天，取1％DNFB丙酮-橄欖油(1∶1)

4、20μL均勻涂布于每只小鼠右耳的兩面進行攻擊。于攻擊24 h后，給小鼠稱重，頸椎脫臼處死，剪下左右耳廓，以左右耳片質(zhì)量差值作為腫脹度，并計算腫脹率。取出脾臟和胸腺稱重并計算相應(yīng)的器官指數(shù)。
　　 1.2.2結(jié)果ZL-5015高、中、低劑量組(200、100、50 mg/kg.b.w)與模型組比較，均能顯著抑制二硝基氟苯誘導(dǎo)的小鼠耳廓腫脹(P=0.000，P=0.000，P=0.015)，抑制率分別為:56.45％、47.58％、

5、29.84％。ZL-5015高劑量(200 mg/kg.b.w)能抑制小鼠的脾臟指數(shù)(P=0.013)，中、低劑量組(100、50 mg/kg.b.w)無抑制作用(P=0.482，P=0.418)。ZL-5015高、中、低劑量組(200、100、50 mg/kg.b.w)對小鼠的胸腺指數(shù)無顯著影響(P=0.384，P=0.527，P=0.570)。
　　 1.3 ZL-5015對網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞（巨噬細胞）吞噬功能的影響（碳粒廓清實

6、驗）
　　 1.3.1材料與方法BALB/c小鼠50只，隨機分為5組，連續(xù)給藥7天。末次給藥1h后，先稱小鼠體重，每只小鼠尾靜脈均注射印度墨汁（用生理鹽水稀釋6倍），按0.1ml/10g注射。分別于注射后于1 min(t1)和10 min(t10)小鼠眼球取血，檢測OD450值，最后將小鼠頸椎脫臼處死，同時摘取小鼠肝臟、脾臟，并稱濕重，計算廓清指數(shù)(K)及吞噬指數(shù)(A)。
　　 1.3.2結(jié)果化合物ZL-5015高、中、

7、低劑量組(200、100、50 mg/kg.b.w)對小鼠吞噬指數(shù)A無明顯影響(P=1.000，P=0.999，P=1.000)。
　　 2.ZL-5015對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的影響
　　 2.1 ZL-5015對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)炎指數(shù)、足趾腫脹度、體重的影響
　　 2.1.1材料與方法雌性SD大鼠48只，隨機分為6組，每只鼠左后足趾皮內(nèi)注射100μL弗氏佐劑，致炎后第16天開始給藥和測量，共給藥12天

8、。采用排水法測足部體積:在大鼠足部踝骨關(guān)節(jié)突出部位劃一條線作為標記，用足趾腫脹儀測量，間隔4天測一次足趾腫脹情況及體重。SD大鼠免疫后，根據(jù)大鼠四肢關(guān)節(jié)炎癥的紅、腫及硬化程度，計算多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)。
　　 2.1.2結(jié)果致炎后第20天，ZL-5015高劑量(200mg/kg.b.w)處理組關(guān)節(jié)炎指數(shù)與模型組比較明顯下降，下降率為20.0％(P=0.010)，說明此時高劑量藥物開始起效。對足趾腫脹及體重?zé)o顯著影響。
　　

9、致炎后第24天，ZL-5015高、中、低劑量(200、100、50mg/kg.b.w)使關(guān)節(jié)炎指數(shù)分別下降34.5％、25.0％、19.0％(P=0.000，P=0.001，P=0.010)。高劑量能使足趾腫脹度下降49.5％(P=0.048)，中、低劑量使足趾腫脹度分別下降40.4％及21.5％，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.194，P=0.845）。對體重有增重趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 致炎后第28天，ZL-5015高、中

10、、低劑量(200、100、50mg/kg.b.w)使關(guān)節(jié)炎指數(shù)分別下降43.0％、36.7％、26.6（P=0.000，P=0.000，P=0.001）。高、中劑量使足趾腫脹分別下降54.0％及48.7％（P=0.034，P=0.041），低劑量下降39.4％，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.150）。對體重有增重趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.2 ZL-5015對弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血清促炎細胞因子的影響
　　 2.2

11、.1材料與方法于佐劑關(guān)節(jié)炎造模第28天，股動脈取血，3000rpm離心10 min，取上清，ELISA方法檢測IL-1β及TNF-α活性。
　　 2.2.2結(jié)果ZL-5015高、中劑量(200、100 mg/kg)與模型組比較，均可顯著降低關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1β的水平(P=0.006，P=0.049)，且有濃度依賴趨勢，抑制率分別為:27.0％，19.1％; ZL-5015低劑量組(50 mg/kg)可以輕微降低大鼠血清IL-

12、1β的水平(P=0.426)。ZL-5015高、中劑量組(200、100 mg/kg)均可以顯著降低大鼠血清TNF-α的水平(P=0.000，P=0.005)，且有濃度依賴趨勢，抑制率分別為:29.2％，21.6％;ZL-5015低劑量組(50 mg/kg)可以輕微降低大鼠血清TNF-α的水平，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.173)。
　　 2.3 ZL-5015對關(guān)節(jié)炎部位促炎細胞因子的影響
　　 2.3.1材料與方法于

13、造模第28天，大鼠斷頭處死，在非致炎側(cè)踝關(guān)節(jié)上方0.5 cm處摘取腫脹的足爪，剪碎，生理鹽水浸泡過夜，離心取上清，ELISA方法檢測IL-1β及TNF-α活性。
　　 2.3.2結(jié)果ZL-5015高、中劑量(200、100 mg/kg)與模型組比較，均可顯著減少關(guān)節(jié)炎部位IL-1β的含量(P=0.000，P=0.019)，且有濃度依賴趨勢，抑制率分別為:30.3％，19.3％;ZL-5015低劑量(50 mg/kg)可以輕微減少

14、炎癥部位IL-1β的含量，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.123)。ZL-5015高、中、低劑量組(200、100、50 mg/kg)均可顯著減少炎癥部位TNF-α的含量(P=0.000，P=0.004，P=0.039)，且有濃度依賴趨勢，抑制率分別為:31.9％，22.0％和15.2％。
　　 3.ZL-5015對淋巴細胞功能的影響
　　 3.1 ZL-5015對ConA和LPS誘導(dǎo)小鼠脾細胞增殖反應(yīng)的影響
　　

15、3.1.1材料與方法Balb/c小鼠兩只，常規(guī)制備脾細胞懸液，ConA(4μg/ml)和LPS(10μg/ml)刺激小鼠脾細胞增殖作為體外免疫模型，檢測給藥48小時后各組細胞的代謝活力。
　　 3.1.2結(jié)果ZL-5015高、中、低劑量均可以顯著抑制Con A誘導(dǎo)的小鼠脾細胞增殖反應(yīng)，(P=0.000，P=0.000，P=0.000)，且有濃度依賴趨勢，抑制率分別是:33.10％、21.0％和13.28％。ZL-5015高、中劑

16、量組均可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細胞增殖反應(yīng)(P=0.000，P=0.000)，且有濃度依賴趨勢，抑制率分別是:25.90％、14.95％，ZL-5015低劑量組有輕微抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細胞增殖反應(yīng)的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.087)。
　　 3.2 ZL-5015對混合淋巴細胞培養(yǎng)反應(yīng)的影響
　　 3.2.1材料與方法將BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠的脾細胞分別制成懸液，按照1∶1混合制成細胞濃

17、度為6×106個/mL的細胞懸液，按分組加入藥物，用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)72 h后各組細胞的代謝活力。
　　 3.2.2結(jié)果ZL-5015高、中、低劑量組均可以顯著抑制混合淋巴細胞的增殖反應(yīng)(P=0.000，P=0.000，P=0.037)，且有濃度依賴趨勢，抑制率分別是:37.2％、17.4％和5.0％。
　　 3.3 ZL-5015對ConA刺激小鼠脾細胞分泌白介素2和干擾素γ的影響
　　 3.3.1材料與方法B

18、alb/c小鼠兩只，常規(guī)制備脾細胞懸液，ConA(4μg/ml)刺激小鼠脾細胞活化，檢測給藥48小時后各組細胞中上清液白細胞介素2和干擾素γ的含量。
　　 3.3.2結(jié)果ZL-5015高、中、低劑量組(40、20、10μM)均可顯著抑制ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細胞分泌白介素2(P=0.000，P=0.000，P=0.007)，且有濃度依賴趨勢，抑制率分別是:29.37％、20.31％和11.35％。ZL-5015高、中、低劑量組(4

19、0、20、10μM)均可以顯著抑制ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細胞分泌干擾素γ(P=0.000，P=0.002，P=0.030)，且有濃度依賴趨勢，抑制率分別是:31.9％、23.6％和15.9％。
　　 3.4 ZL-5015對小鼠脾細胞細胞因子mRNA表達的抑制作用
　　 3.4.1材料與方法Balb/c小鼠兩只，常規(guī)制備脾細胞懸液，ConA（4μg/ml）刺激小鼠脾細胞活化，使用熒光定量PCR檢測給藥48小時后各組細胞中白

20、細胞介素2和干擾素γmRNA表達的變化。
　　 3.4.2結(jié)果ZL-5015(40、20、10μM)可抑制由ConA誘導(dǎo)的IL-2 mRNA的表達(P=0.010，P=0.024，P=0.048)。ZL-5015(40、20、10μM)可抑制由ConA誘導(dǎo)的INF-γ mRNA的表達(P=0.005，P=0.013，P=0.043)。
　　 3.5 ZL-5015對LPS刺激小鼠脾細胞分泌IgG1和IgG2a的影響

21、>　　 3.5.1材料與方法Balb/c小鼠兩只，常規(guī)制備脾細胞懸液，LPS(10μg/ml)刺激小鼠脾細胞活化，各組給藥作用48小時后，收集培養(yǎng)上清液檢測IgG1和IgG2a的含量。
　　 3.5.2結(jié)果ZL-5015高、中劑量組(40、20μM)均可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細胞分泌IgG1，(P=0.000，P=0.001)，且有濃度依賴趨勢，抑制率分別是:27.8％、18.0％;ZL-5015低劑量組(10μM)可以

22、輕微抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細胞分泌IgG1，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.105)。ZL-5015高、中、低劑量組(40、20、10μM)均可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細胞分泌IgG2a(P=0.000，P=0.000，P=0.011)，且有濃度依賴趨勢，抑制率分別是:31.6％、22.7％和13.7％。
　　 3.6 ZL-5015對T細胞亞類的影響
　　 3.6.1材料與方法脾細胞制備、實驗分組及給藥均同3.5.1所

23、述，48小時后收集細胞，用熒光標記的抗小鼠CD3、CD4、CD8抗體染色，流式細胞儀檢測。
　　 統(tǒng)計方法:
　　 3.6.2結(jié)果ZL-5015主要降低ConA誘導(dǎo)的CD4弱表達和CD3弱表達T細胞亞群(CD4LwCD3Low)的比例。
　　 統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。T細胞亞類占細胞總數(shù)的比例以百分數(shù)表示，先采用R×C表資料的卡方檢驗對各組細胞的百分率差異進行多組間的總體檢驗，然后采

24、用四格表資料的卡方檢驗進行組間細胞百分率的兩兩比較。定量數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，采用單向方差分析法分析，先進行方差齊性檢驗，若方差齊用LSD方法多重比較;若方差不齊，采用Welch F檢驗和Dunnett's T3法多重比較。顯著性水準取α=0.05，以P＜0.05時，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、ZL-5015可降低兔紅細胞誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生血清溶血素的活性，降低二硝基氟苯誘導(dǎo)的小鼠耳廓的腫脹度，對小

25、鼠碳粒廓清的速率無明顯影響，提示對小鼠的體液免疫及細胞免疫功能有抑制作用，對非特異性免疫功能無影響。
　　 2、ZL-5015可以減輕弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎模型的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，足趾腫脹，提示對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有一定的臨床應(yīng)用前景。
　　 3、ZL-5015可以減少弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎模型血清及炎癥部位中的促炎細胞因子IL-1β和TNF-α的含量，提示對佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用與抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生與關(guān)。
　　 4、ZL-5015可

26、抑制ConA和LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細胞的增殖反應(yīng)，提示對T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖反應(yīng)有直接的抑制作用。
　　 5、ZL-5015可以顯著抑制混合淋巴細胞的增殖反應(yīng)（代謝活力），提示對特異抗原誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖反應(yīng)有直接的抑制作用。
　　 6、ZL-5015可以顯著抑制ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細胞分泌白介素2和干擾素γ，提示其免疫抑制作用與抑制細胞因子的產(chǎn)生與分泌有關(guān)。
　　 7、ZL-5015可抑制由Con A誘導(dǎo)

27、的IL-2及INF-γ mRNA的表達，提示其抑制細胞因子產(chǎn)生的作用環(huán)節(jié)在mRNA表達水平。
　　 8、ZL-5015可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細胞分泌IgG1和IgG2a，提示其可直接作用于B淋巴細胞而抑制抗體的產(chǎn)生。
　　 9、ZL-5015可降低Con A誘導(dǎo)的CD4弱表達和CD3弱表達T細胞亞群(CD4LowCD3Low)的比例，提示其作用機制可能是抑制CD4+CD3+細胞的活化與增殖，從而抑制免疫反應(yīng)。