消栓通絡(luò)方有效成分組對(duì)缺血性腦血管疾病的防治作用與機(jī)理研究.pdf

1、中風(fēng)是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的三大疾病之一，是因病致殘的首要原因，也是世界范圍內(nèi)一個(gè)主要的公共健康負(fù)擔(dān)。對(duì)中風(fēng)病理生理和防治藥物的長(zhǎng)期研究表明，這類(lèi)危險(xiǎn)因素眾多、病理生理變化繁復(fù)的復(fù)雜性疾病，單純針對(duì)某一個(gè)單一的分子靶點(diǎn)，甚或某一單一類(lèi)型的細(xì)胞，都難以收到良好的治療效果(如神經(jīng)保護(hù)劑的研發(fā)現(xiàn)狀)。故而近年來(lái)提出了聯(lián)合治療和雞尾酒療法的設(shè)想，并已有部分方案進(jìn)入臨床。中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)一貫主張和強(qiáng)調(diào)綜合調(diào)理，強(qiáng)調(diào)調(diào)動(dòng)人體自身的代償與防衛(wèi)體系來(lái)抵御各種致病因

2、素的不良影響?；钛鏊幭ㄍńj(luò)方以血管和經(jīng)絡(luò)為起點(diǎn)而通達(dá)全身，調(diào)動(dòng)軀體網(wǎng)絡(luò)的多種細(xì)胞與分子成分，促進(jìn)腦血管病變后的結(jié)構(gòu)和功能重塑，從而發(fā)揮其防治腦血管疾病的效應(yīng)。然而我們對(duì)其作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理等尚缺乏較為系統(tǒng)深入的了解。本研究結(jié)合多年來(lái)中藥現(xiàn)代研究經(jīng)驗(yàn)和中醫(yī)藥的系統(tǒng)整體觀(guān)念，在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，探討了消栓通絡(luò)方有效成分組對(duì)缺血性腦血管疾病的防治效應(yīng)與作用機(jī)理。 ⑴消栓通絡(luò)方有效成分組的篩選與確定。根據(jù)腦缺血損傷的病

3、理生理基礎(chǔ)，選用內(nèi)皮細(xì)胞低氧損傷模型、血管環(huán)舒張實(shí)驗(yàn)、神經(jīng)細(xì)胞低氧損傷模型、腦線(xiàn)粒體脂質(zhì)過(guò)氧化模型以及DPPH氧自由基清除模型，對(duì)多種萃取方法以及大孔樹(shù)脂方法從消栓通絡(luò)方中制備的16個(gè)組分進(jìn)行了兩輪篩選。在前期138個(gè)連續(xù)組分篩選的基礎(chǔ)上，結(jié)合上述各模型篩選和各組分成分分析結(jié)果，以及規(guī)模生產(chǎn)的需要，確定了消栓通絡(luò)方的有效成分組及制備工藝。 ⑵消栓通絡(luò)方有效成分組對(duì)缺血性腦血管疾病的防治效應(yīng)。①消栓通絡(luò)方有效成分組對(duì)右旋糖酐所致血

4、瘀和腦微循環(huán)障礙的影響。小鼠經(jīng)尾靜脈注射右旋糖酐和伊文思蘭后出現(xiàn)明顯的血瘀征象，同時(shí)有微循環(huán)障礙，腦血流量下降31.6±10.8％，而預(yù)先灌胃給予消栓通絡(luò)方有效成分組可以緩解血瘀征象，改善腦部微循環(huán)障礙。②消栓通絡(luò)方有效成分組對(duì)大鼠急性腦缺血損傷的保護(hù)作用。大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞24小時(shí)后，動(dòng)物出現(xiàn)明顯的神經(jīng)行為功能障礙，大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域出現(xiàn)較大范圍的梗死(28.8±3.5％)。消栓通絡(luò)方有效成分組(XECG)能縮小腦梗死范圍，改善神經(jīng)行

5、為障礙。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，XECG能抑制缺血后異常激活的iNOS，降低腦內(nèi)異常升高的NO水平。同時(shí)缺血后腦內(nèi)白細(xì)胞浸潤(rùn)增加，MPO活性升高，而XECG能有效抑制MPO活性的異常升高。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，XECG能抑制缺血后腦內(nèi)促凋亡蛋白Bax的過(guò)度表達(dá)，有助于Bcl—2家族平衡的回復(fù)。上述結(jié)果提示XECG可能通過(guò)抑制iNOS的過(guò)度激活和缺血后炎癥反應(yīng)，抑制缺血后組織細(xì)胞凋亡等多種途徑改善腦缺血損傷。③消栓通絡(luò)方有效成分組對(duì)大鼠慢性腦缺血損傷的保護(hù)作用。

6、大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎致長(zhǎng)期慢性缺血后，腦內(nèi)，尤其是海馬區(qū)神經(jīng)元損傷與脫失明顯，同時(shí)可見(jiàn)腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，小膠質(zhì)細(xì)胞活化，并有白質(zhì)疏松和脫髓鞘現(xiàn)象。KB染色發(fā)現(xiàn)纖維排列紊亂并有空泡形成，部分甚至可見(jiàn)有髓鞘神經(jīng)纖維消失。Morris水迷宮檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，XECG能改善慢性腦缺血所致的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力缺陷。同時(shí)，組織病理學(xué)檢查和免疫組化結(jié)果顯示，XECG可改善缺血所致的海馬區(qū)神經(jīng)元損傷與脫失，改善腦白質(zhì)疏松。④消栓通絡(luò)方有效成分組對(duì)缺血后腦血管

7、反應(yīng)性的影響。已有的基礎(chǔ)與臨床研究表明腦缺血后血管反應(yīng)性降低，而且血管反應(yīng)性的高低也和中風(fēng)患者的臨床預(yù)后有關(guān)。通過(guò)對(duì)大鼠腦缺血后胸主動(dòng)脈的收縮反應(yīng)以及乙酰唑胺負(fù)荷實(shí)驗(yàn)中腦血流量變化的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后大鼠血管反應(yīng)性明顯降低，而XECG則能明顯改善缺血后的腦血管反應(yīng)性，注射乙酰唑胺后腦血流量的增加由模型對(duì)照組的2.1±1.8％上升至高劑量組的21.4±8.4％。腦血管灌注造影結(jié)果顯示，XECG給藥組大腦后動(dòng)脈等較對(duì)照組有所增

8、粗，側(cè)枝循環(huán)改善。 ⑶消栓通絡(luò)方有效成分組防治腦缺血損傷的作用機(jī)制研究。①XECG對(duì)腦缺血后血管新生的影響。腦缺血后血管新生在組織修復(fù)與功能重建中起重要作用，與中風(fēng)患者的生存期呈正相關(guān)。本部分實(shí)驗(yàn)采用Ki67和vWf免疫組化標(biāo)記檢測(cè)缺血后血管管徑、密度以及內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，XECG給藥組腦內(nèi)毛細(xì)血管密度增加，管徑有所增大，內(nèi)皮細(xì)胞增殖明顯。提示XECG能促進(jìn)缺血后血管生成。這也可能是其改善缺血后腦血流與血管反應(yīng)性的基礎(chǔ)

9、之一。②XECG對(duì)缺血后腦內(nèi)生化與分子環(huán)境的影響。中藥復(fù)方不僅通過(guò)直接影響相關(guān)的分子靶標(biāo)而發(fā)揮作用，更在于改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境，充分調(diào)動(dòng)機(jī)體各種內(nèi)源性的力量而發(fā)揮其防病治病效應(yīng)。腦缺血后的血管新生與神經(jīng)再生等重塑過(guò)程也依賴(lài)于全身和局部分子及細(xì)胞環(huán)境的改善。通過(guò)對(duì)缺血后血液粘度、腦內(nèi)NO含量、iNOS活性的測(cè)定，以及VEGF、BDNF、APJ、Tie—2和Flk的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)XECG能降低血液粘度，改善血液流動(dòng)環(huán)境。而且能降低腦內(nèi)異常激活的iNO

10、S活性和NO的異常升高，同時(shí)能促進(jìn)VEGF等促血管生成因子的表達(dá)，從而為缺血后的血管生成和功能重建提供了有益的機(jī)體環(huán)境。③XECG及消栓通絡(luò)方中部分化合物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞低氧損傷的作用與機(jī)制研究。氯化鈷能有效模擬低氧所誘導(dǎo)的多種分子事件，本部分實(shí)驗(yàn)采用氯化鈷誘導(dǎo)EA．hy926內(nèi)皮細(xì)胞低氧損傷模型，探討XECG內(nèi)主要組分和化合物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞低氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，XECG內(nèi)多種組分對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞低氧損傷有不同程度的保護(hù)作用，其中金絲