從調(diào)控線粒體自噬探討小續(xù)命湯有效成分組對缺血性腦卒中的作用機制.pdf

1、腦卒中又稱腦中風或腦血管意外，是由于腦部供血障礙或腦血管破裂引起的一種急性腦血管疾病，分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩種，死亡率和致殘率極高，嚴重威脅著人類的生命健康。然而，由于缺血性腦卒中病理進程復雜，迄今為止正式被批準使用的有效治療藥物還為數(shù)不多。中藥復方小續(xù)命湯是治療缺血性腦卒中的經(jīng)典方劑，小續(xù)命湯有效成分組是依據(jù)小續(xù)命湯適應癥腦缺血的發(fā)病機制，通過體外篩選模型優(yōu)化確定的小續(xù)命湯抗腦缺血的有效藥理活性組分。前期研究證實小續(xù)命湯有效

2、成分組能夠作用于缺血區(qū)神經(jīng)細胞線粒體，顯著改善缺血后神經(jīng)元線粒體能量代謝障礙，提高線粒體膜電位，抑制線粒體凋亡途徑。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷與線粒體自噬功能紊亂有著密切的聯(lián)系，缺血性損傷導致線粒體功能受損，而線粒體自噬清除受損線粒體，完成損傷線粒體的降解，維持自身穩(wěn)態(tài)平衡，實現(xiàn)線粒體質(zhì)量控制，因此靶向調(diào)節(jié)線粒體自噬或能降低腦缺血再灌注損傷。
　　基于此，本課題以線粒體自噬為切入點，提出線粒體網(wǎng)絡的穩(wěn)態(tài)失衡在缺血性腦卒中發(fā)

3、生發(fā)展過程中具有重要意義，小續(xù)命湯有效成分組可通過調(diào)節(jié)線粒體自噬，調(diào)控線粒體穩(wěn)態(tài)失衡改善神經(jīng)元功能來治療缺血性腦卒中。因此，本研究采用局灶性腦缺血再灌注大鼠為觀察對象，以小續(xù)命湯有效成分組為干預手段，探討小續(xù)命湯有效成分組對模型大鼠腦缺血改善情況，觀察其對線粒體功能及線粒體自噬變化的影響，從調(diào)節(jié)線粒體自噬的角度揭示小續(xù)命湯有效成分組對缺血性腦卒中的作用機制。
　　第一部分 小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦線粒體功能損傷

4、的影響
　　目的：考察小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦線粒體功能損傷的影響。
　　方法：選用健康雄性SD大鼠，體重250g-280g，隨機分為假手術(Sham)組、模型(Model)組、小續(xù)命湯有效成分組(XXMD)低、中、高劑量組和金納多(EGb761)組，插線法制備大鼠右側大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)模型，缺血2h后實現(xiàn)再灌注，假手術組大鼠不進行線栓插入操作。待大鼠清醒后給予藥物，小續(xù)命湯有效成分組和金納

5、多均采用灌胃給藥，每日一次，連續(xù)四天。測定給藥4天時MCAO大鼠缺血周邊區(qū)大腦皮層組織線粒體膜腫脹度、ATP酶活性(Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase)以及線粒體超氧陰離子(O2-)和鈣離子含量，研究小續(xù)命湯有效成分組對腦缺血再灌注大鼠腦線粒體功能的影響。
　　結果：與模型組相比，給藥4天時小續(xù)命湯有效成分組能夠顯著改善MCAO大鼠的腦線粒體功能損傷，表現(xiàn)為顯著改善腦缺血再灌注大鼠腦線粒體Na+-K+-A

6、TPase(P＜0.05，P＜0.01)和Ca2+-Mg2+-ATPase活力(P＜0.05，P＜0.01)，降低線粒體鈣離子含量(P＜0.01）和超氧陰離子含量(P＜0.05）。
　　結論：小續(xù)命湯有效成分組能夠減輕腦缺血再灌注導致的線粒體氧化應激反應和鈣超載，改善線粒體功能。
　　第二部分 小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦線粒體自噬的影響及作用機制研究
　　目的：考察小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌

7、注大鼠皮層神經(jīng)元不同時間點線粒體自噬的影響及相關機制。
　　方法：選用健康雄性SD大鼠，體重250g-280g，隨機分為假手術(Sham)組、模型(Model)組、小續(xù)命湯有效成分組（XXMD）中劑量組和自噬激活劑雷帕霉素(RAP)組，插線法制備大鼠右側大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)模型，缺血2h后實現(xiàn)再灌注，假手術組大鼠不進行線栓插入操作。待大鼠清醒后給予藥物，小續(xù)命湯有效成分組采用灌胃給藥，雷帕霉素采用腹腔注射給藥，每日一次

8、，連續(xù)四天。采用Zea-Longa's級標準評分法和神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)實驗來測評小續(xù)命湯有效成分組和雷帕霉素給藥對局灶性腦缺血再灌注大鼠行為學的影響，TTC染色法檢測大鼠腦梗死體積百分比和半球腫脹。Western blot法檢測給藥后24h、48h、72h和96h時自噬及線粒體自噬相關蛋白LC3、P62、Beclin-1及BNIP3的表達水平變化，透射電鏡觀察再灌注24h時缺血半暗帶皮層神經(jīng)元細胞中線粒體形態(tài)及線粒體自噬超微結

9、構。
　　結果：與模型組相比，給藥4天時小續(xù)命湯有效成分組和雷帕霉素能夠顯著改善MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損，表現(xiàn)為降低MCAO大鼠mNSS評分(P＜0.05，P＜0.01)，延長MCAO大鼠在平衡木上的停留時間(P＜0.05，P＜0.01)。TTC結果顯示，小續(xù)命湯有效成分組和雷帕霉素能夠顯著減少給藥4天時MCAO大鼠腦組織梗死體積百分比(P＜0.05，P＜0.01)，并可顯著縮小其半球腫脹(P＜0.01）。Western blot

10、檢測結果顯示，腦缺血再灌注24h時，缺血周邊區(qū)腦組織中自噬及線粒體自噬均被顯著激活，表現(xiàn)為細胞總蛋白和純化線粒體蛋白中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化顯著增多(P＜0.05，P＜0.01)，細胞總蛋白中P62、Beclin-1及BNIP3的表達水平發(fā)生下降（P＜0.05），而純化線粒體蛋白中P62及BNIP3的表達水平則顯著上升(P＜0.05，P＜0.01)。缺血再灌注48h時線粒體自噬被抑制，且隨著再灌注時間的延長，線粒體自噬出現(xiàn)持續(xù)下降

11、現(xiàn)象。與模型組相比，小續(xù)命湯有效成分組給藥24h時，能夠通過降低P62、Beclin-1、BNIP3的表達水平以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值(P＜0.05，P＜0.01)抑制腦缺血再灌注后24h時線粒體自噬的過度激活。其對線粒體自噬的抑制作用延續(xù)至再灌注48h，隨著時間進一步延長，小續(xù)命湯有效成分組對線粒體自噬的抑制作用消失。缺血再灌注時間延長至96h時，小續(xù)命湯有效成分組對P62、Beclin-1及BNIP3的表達出現(xiàn)明顯激活作用(

12、P＜0.05，P＜0.01），并能增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(P＜0.05)，從而激活線粒體自噬，促進受損線粒體的自噬性清除。電鏡檢測結果顯示，腦缺血再灌注24h時，模型組大鼠腦組織神經(jīng)元細胞中有大量空泡結構的自噬泡及大量線粒體自噬結構。與模型組相比，XXMD給藥組大鼠腦神經(jīng)元核膜較為完整，細胞器較模型組明顯增多，自噬泡及線粒體自噬結構明顯減少。
　　結論：腦缺血再灌注后線粒體自噬隨病程進展呈現(xiàn)先激活后抑制現(xiàn)象，過高和過低的線

13、粒體自噬均不利于神經(jīng)細胞的存活。小續(xù)命湯有效成分組能夠調(diào)節(jié)缺血后不同時間點自噬及線粒體自噬相關蛋白的表達水平，抑制缺血再灌注后24h時線粒體自噬的過度激活，促進缺血再灌注后期線粒體自噬。
　　第三部分 應用線粒體自噬抑制劑后觀察小續(xù)命湯有效成分組對腦缺血再灌注損傷的影響
　　目的：考察應用線粒體自噬抑制劑mdivi-1后對小續(xù)命湯有效成分組腦缺血再灌注損傷保護作用的影響及機制。
　　方法：選用健康雄性SD大鼠，體重25

14、0g-280g，隨機分為假手術(Sham)組、模型(Model)組、小續(xù)命湯有效成分組(XXMD)中劑量組、小續(xù)命湯有效成分組聯(lián)合線粒體自噬抑制劑mdivi-1作用(XXMD+MDI)組及線粒體自噬抑制劑mdivi-1組，插線法制備大鼠右側大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)模型，缺血2h后實現(xiàn)再灌注，假手術組大鼠不進行線栓插入操作。待大鼠清醒后給予藥物，小續(xù)命湯有效成分組采用灌胃給藥，mdivi-1采用腹腔注射給藥，每日一次，連續(xù)四天。采

15、用Zea-Longa's級標準評分法和神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)實驗來觀察小續(xù)命湯有效成分組以及小續(xù)命湯有效成分組聯(lián)合mdivi-1給藥對局灶性腦缺血再灌注大鼠行為學的影響，TTC染色法檢測大鼠腦梗死體積百分比和半球腫脹，Western blot法檢測給藥4天時，MCAO大鼠腦線粒體中自噬及線粒體自噬相關蛋白LC3、P62、Beclin-1及BNIP3的表達水平。
　　結果：與XXMD組相比，應用線粒體自噬抑制劑mdivi-1后

16、，小續(xù)命湯有效成分組對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用顯著減弱，表現(xiàn)為MCAO大鼠mNSS評分升高(P＜0.05），在平衡木上的停留時間減少(P＜0.05），腦組織梗死體積百分比增多(P＜0.01），并可增加其半球腫脹(P＜0.05）。Western blot檢測結果顯示，應用線粒體自噬抑制劑mdivi-1后，小續(xù)命湯有效成分組大鼠腦線粒體P62和Beclin-1的表達降低(P＜0.05，P＜0.01)，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化減少(