調(diào)控星形膠質(zhì)細胞自噬流水平對缺血性腦卒中病程中神經(jīng)元存活的影響.pdf

1、腦卒中是全球成人致殘的首位因素，在我國已經(jīng)超越癌癥成為第一位的致死性疾病。眾所周知，神經(jīng)元對缺血及變性等損傷極為敏感且一旦發(fā)生損傷或壞死就難以自身修復(fù)再生，損傷所致的神經(jīng)細胞死亡是缺血性腦卒中和神經(jīng)變性疾病致殘率居高不下的根本原因。但目前國際上尚無有效的針對神經(jīng)損傷和壞死發(fā)揮直接修復(fù)作用的藥物或干預(yù)措施。
　　在不同類型的急性腦損傷中，自噬發(fā)揮不同的作用?，F(xiàn)有觀點認為，自噬在精神藥物所致的毒性損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血和脊柱損傷中起著神

2、經(jīng)保護作用；在新生兒缺血缺氧損害中，自噬性細胞死亡則造成神經(jīng)元的死亡。然而自噬在腦卒中損傷中發(fā)揮怎樣的作用目前尚不清楚。既往研究大多集中在調(diào)控神經(jīng)元自噬流水平在急性腦損傷中發(fā)揮的作用，對星形膠質(zhì)細胞自噬流在急性腦損傷中的作用認識尚缺。哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細胞占所有膠質(zhì)細胞的大多數(shù)，在維持血腦屏障和調(diào)控局部腦血流方面發(fā)揮重要作用，同時還可以通過釋放營養(yǎng)因子、抗氧化因子向神經(jīng)元提供代謝支持，在神經(jīng)遞質(zhì)循環(huán)、調(diào)控突觸可塑性和突觸傳

3、遞方面也發(fā)揮重要作用。神經(jīng)元可以釋放損傷的線粒體并將其轉(zhuǎn)運入星形膠質(zhì)細胞中，最新的研究證明，腦缺血過程中星形膠質(zhì)細胞可以向神經(jīng)元提供有功能的線粒體，從而提高缺血損傷后神經(jīng)元的存活。提示，神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細胞之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運可能是卒中后機體重要的內(nèi)源性保護機制。那么，調(diào)控星形膠質(zhì)細胞的自噬流水平是否也能提高神經(jīng)元在腦卒中后的存活呢？目前尚未見研究。
　　本研究旨在探索調(diào)控星形膠質(zhì)細胞自噬流水平對氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧以及腦缺血再灌注后神經(jīng)

4、元存活的影響，從而發(fā)揮腦保護作用。
　　實驗一原代神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞OGD后自噬流的時程變化
　　目的：研究原代神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞在OGD/復(fù)糖復(fù)氧過程中自噬流水平變化規(guī)律。
　　方法：1、分別培養(yǎng)原代神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，將神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞隨機分為6組：Sham組，OGD1 h/復(fù)糖復(fù)氧（0 h,6 h,12 h,24 h,48 h）組；另將星形膠質(zhì)細胞分為6組：Sham組，OGD4 h/復(fù)糖復(fù)氧（0 h,6

5、 h,12h,24 h,48 h）組；使用Western Blot的方法檢測自噬流的標記蛋白LC3、p62的表達；使用透射電鏡觀察每組神經(jīng)元的自噬小體、自噬溶酶體的數(shù)量。此外，將神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞隨機分為2組：雷帕霉素處理組和對照組。使用Western Blot檢測各組細胞自噬流的標記蛋白的表達，對各組細胞分別感染mRFP-GFP-LC3慢病毒，待病毒感染穩(wěn)定后，通過熒光觀察神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的自噬流水平。
　　結(jié)果：1、神經(jīng)

6、元自噬流在正常狀態(tài)下處于較低水平，OGD后即刻自噬水平上調(diào)（P＜0.05），在復(fù)糖復(fù)氧12 h時自噬流抑制，降到基礎(chǔ)水平，隨后自噬流被重新上調(diào)，在復(fù)糖復(fù)氧24 h以及48 h升高（P＜0.05）。雷帕霉素處理后，神經(jīng)元自噬流升高（P＜0.01）。
　　2、星形膠質(zhì)細胞自噬流在正常狀態(tài)下處于較高水平，OGD1 h對星形膠質(zhì)細胞自噬流影響不大，OGD4 h/復(fù)糖復(fù)氧后自噬流水平開始下降，在復(fù)糖復(fù)氧12 h時降到最低（P＜0.05），隨

7、后自噬上調(diào)，在24 h以及48 h自噬流再次升高，幾乎和基礎(chǔ)狀態(tài)下一致。雷帕霉素處理后，星形膠質(zhì)細胞自噬流升高（P＜0.01）。
　　結(jié)論：1、OGD后神經(jīng)元自噬流水平處于波動狀態(tài)，在復(fù)糖復(fù)氧即刻自噬水平迅速上調(diào)，而在6h以及12 h時降低，在復(fù)糖復(fù)氧24 h自噬水平重新上調(diào)。2、OGD后星形膠質(zhì)細胞自噬流水平處于波動狀態(tài)，在復(fù)糖復(fù)氧后自噬水平逐漸下降，并在12 h時降到最低低，在復(fù)糖復(fù)氧24 h自噬水平重新上調(diào)為正常狀態(tài)水平。<

8、br>　　實驗二星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元應(yīng)對OGD損傷能力的影響
　　目的：觀察星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)相比神經(jīng)元單獨培養(yǎng)，神經(jīng)元應(yīng)對OGD損傷能力有無改變。
　　方法：單獨培養(yǎng)原代神經(jīng)元，將神經(jīng)元分為4組：Sham組，OGD(15 min,30 min,60 min)/ R(24 h)組；單獨培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞，將星形膠質(zhì)細胞分為2組：Sham組， OGD1 h/ R(24 h)組，分別觀察各組神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的活力。隨后

9、，將神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞進行間接共培養(yǎng)，并分為2組：Sham組，OGD1 h/ R(24 h)，檢測共培養(yǎng)下的神經(jīng)元的細胞活力。
　　結(jié)果：原代神經(jīng)元在OGD60 min復(fù)糖復(fù)氧24小時處理后，其細胞活力相比對照組降低至65％左右（P＜0.001），而星形膠質(zhì)細胞OGD處理后其細胞活力與對照組無明顯差異；共培養(yǎng)下的神經(jīng)元OGD處理后其細胞活力相比對照組下降至80%（P＜0.01），共培養(yǎng)神經(jīng)元的活力明顯高于單獨培養(yǎng)下的神經(jīng)元。

10、r>　　結(jié)論：神經(jīng)元易受缺血缺氧打擊，而星形膠質(zhì)細胞耐受缺血缺氧打擊的能力較強，星形膠質(zhì)細胞增強了神經(jīng)元應(yīng)對OGD損傷的能力。
　　實驗三調(diào)控星形膠質(zhì)細胞自噬流水平對其自身應(yīng)對OGD損傷的影響
　　目的：分別上調(diào)或下調(diào)星形膠質(zhì)細胞自噬流水平，隨后給予OGD4 h/復(fù)糖復(fù)氧24 h，觀察星形膠質(zhì)細胞在不同的自噬流水平下應(yīng)對OGD損傷的能力。
　　方法：培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細胞，將星形膠質(zhì)細胞分為5組：Sham組，Ctrl組、

11、雷帕霉素（RAPA）處理組、3-甲基腺嘌呤（3-MA）組、小干擾RNA靶向自噬相關(guān)基因7（siATG7）組，以上調(diào)或下調(diào)星形膠質(zhì)細胞自噬流水平，后四組給予OGD4 h復(fù)糖復(fù)氧24 h，觀察各組星形膠質(zhì)細胞在不同的自噬流水平下應(yīng)對OGD損傷的能力有無改變。
　　結(jié)果：在基因水平上干擾自噬相關(guān)基因ATG7的表達降低了星形膠質(zhì)細胞應(yīng)對
　　OGD損傷的能力（P＜0.001）；上調(diào)星形膠質(zhì)細胞自噬流水平有增加星形膠質(zhì)細胞應(yīng)對OGD損

12、傷能力的趨勢（P=0.0553），然而并沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：抑制星形膠質(zhì)細胞自噬流水平降低其應(yīng)對OGD損傷的能力，意味著星形膠質(zhì)自噬對其自身功能的維持發(fā)揮著重要作用。
　　實驗四調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞自噬流水平對神經(jīng)元在正常狀態(tài)以及OGD后存活的影響
　　目的：研究調(diào)控星形膠質(zhì)細胞自噬流水平后對神經(jīng)元存活的影響。
　　方法：1、培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細胞，將星形膠質(zhì)細胞分為4組：對照組，RAPA處理組，3-MA處理組

13、，siATG5處理組以上調(diào)或下調(diào)星形膠質(zhì)細胞自噬流水平，隨后將各組的星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元進行間接共培養(yǎng)并分別給予Sham和OGD(1 h)復(fù)糖復(fù)氧24 h處理，觀察各組神經(jīng)元的凋亡、細胞活力并檢測共培養(yǎng)體系中LDH的釋放量。
　　結(jié)果：1、在正常情況下調(diào)控星形膠質(zhì)細胞自噬流水平對神經(jīng)元的凋亡、存活以及共培養(yǎng)體系中LDH的釋放無影響。2、OGD情況下上調(diào)星形膠質(zhì)細胞自噬流減少神經(jīng)元的凋亡（P＜0.01），增強神經(jīng)元活力（P＜0.01

14、），減少共培養(yǎng)體系中的LDH釋放量（P＜0.05），而抑制星形膠質(zhì)細胞增加神經(jīng)元的凋亡（P＜0.05, P＜0.01），降低神經(jīng)元活力（P＜0.05, P＜0.001），增加共培養(yǎng)體系中的LDH釋放量（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1、在正常情況下調(diào)控星形膠質(zhì)細胞自噬流水平對神經(jīng)元無顯著性影響。2、OGD損傷后上調(diào)星形膠質(zhì)細胞自噬流水平能夠增加神經(jīng)元的存活，發(fā)揮了細胞保護作用，而抑制星形膠質(zhì)細胞自噬流水平可降低神經(jīng)元的存活發(fā)揮細胞毒

15、性作用。
　　實驗五在體調(diào)控星形膠質(zhì)細胞自噬流水平對腦缺血再灌注后腦梗塞范圍和神經(jīng)元存活的影響
　　目的：研究調(diào)控星形膠質(zhì)細胞自噬流水平對小鼠MCAO1 h/ R24 h后腦梗死范圍和神經(jīng)元存活的影響。
　　方法：野生型C57BL6小鼠隨機分為2組：AAV-GFAP-GFP組和AAV-GFAP-ATG7組。分別于缺血半暗帶區(qū)注射以上兩種病毒，3周后待腺相關(guān)病毒感染穩(wěn)定，建立MCAO/ R模型。通過TTC染色檢測各組動物