敲除DAPK1死亡結(jié)構(gòu)域?qū)θ毖阅X卒中神經(jīng)元保護(hù)作用研究.pdf

1、背景：
　　死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPkinase,DAPK)是一類新的鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴激酶。最初，科學(xué)家主要研究它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤轉(zhuǎn)移方面的作用。目前有研究證實(shí)DAPK1同時(shí)也參與缺血性腦中風(fēng)時(shí)的繼發(fā)性神經(jīng)元死亡。腦卒中是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病及多發(fā)病，死亡率和致殘率很高，往往給患者帶來諸多不良后果。因此對(duì)腦卒中發(fā)病機(jī)制的研究顯得尤其重要。DAPK1蛋白質(zhì)主要由6個(gè)部位組成，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在缺血性腦卒中誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡起主要作用的

2、是DAPK1的死亡結(jié)構(gòu)域(Death Domain)，該區(qū)可以與多種蛋白結(jié)合，引起細(xì)胞死亡，而目前還沒有報(bào)告關(guān)于在小鼠整體水平上敲除DAPK1死亡結(jié)構(gòu)域的研究。
　　目的:
　　1.論證敲除DAPK1-DD對(duì)缺血性腦卒中神經(jīng)元的保護(hù)作用
　　2.探討敲除DAPK1-DD對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響
　　材料與方法:
　　首先，為敲除DAPK1-DD，我們運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在DAPK1的第25個(gè)內(nèi)含子和第27個(gè)啟動(dòng)子

3、的下游插入LoxP位點(diǎn)制造flox小鼠，然后讓其與CaMKIIα-Cre小鼠雜交，在小鼠80天左右用他莫昔芬誘導(dǎo)cre的表達(dá)，達(dá)到敲除DAPK1-DD的目的。運(yùn)用免疫組化的方法驗(yàn)證cre的表達(dá)。敲除DAPK1-DD之后我們將進(jìn)行水迷宮測(cè)試檢測(cè)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。為論證敲除DAPK1-DD對(duì)腦缺血有保護(hù)作用，我們對(duì)腦缺血模型(MCAO)小鼠進(jìn)行了TTC染色和核磁共振成像(MRI)，在體外實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)谠囵B(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞上進(jìn)行糖氧剝奪實(shí)驗(yàn)

4、(OGD)后再對(duì)其進(jìn)行Tunel染色。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建DAPK1-DD敲除小鼠模型
　　2.部分敲除DAPK1-DD對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育及自主行為沒有影響
　　3.部分敲除DAPK1-DD對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶沒有影響
　　4.整體水平上，敲除部分DAPK1-DD對(duì)腦缺血無保護(hù)作用
　　5.原代神經(jīng)元模型，敲除DAPK1-DD對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用
　　結(jié)論:
　　DAPK1在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中