亞甲藍(lán)對缺血性腦卒中的保護(hù)性作用.pdf

1、腦卒中(stroke)是嚴(yán)重影響人類身體健康，甚至威脅生命的疾病。在我國，位列疾病死因第一位，每年發(fā)生腦卒中的病人達(dá)200萬。腦卒中分為兩類:缺血性腦卒中和出血性腦卒中，在我國缺血性卒中所占的比率為60％-80％。過去認(rèn)為缺血腦組織無法挽救，腦缺血半暗帶理論對于腦卒中的治療起到突破性的作用，使得腦梗塞的溶栓治療成為可能。然而，由于治療時(shí)間窗過窄(美國的治療時(shí)間窗為4.5h，我國的治療時(shí)間窗為6h)，并有出現(xiàn)嚴(yán)重出血并發(fā)癥的危險(xiǎn)，溶栓治療

2、一直無法廣泛應(yīng)用，即使在發(fā)達(dá)國家，也僅有約5％的缺血性腦卒中患者能夠接受溶栓治療。因此，尋找一種切實(shí)有效的、緩解缺血性腦卒中損傷的神經(jīng)保護(hù)劑的研究具有重要的臨床意義。
　　亞甲藍(lán)(Methylene blue，MB)，是雜環(huán)芳香族化合物，自19世紀(jì)被PaulEhrlich引入生物界，MB已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床。MB的主要特性之一是作用迅速，靜脈給藥5min內(nèi)即可到達(dá)峰濃度。另一主要特性是對神經(jīng)組織具有高度親和力，可以輕易透過血腦屏障

3、并積累在神經(jīng)組織中。一旦進(jìn)入細(xì)胞，MB很容易在線粒體質(zhì)子電勢的作用下進(jìn)入線粒體基質(zhì)中。
　　線粒體是進(jìn)行能量代謝、維持氧化還原平衡的重要細(xì)胞器。它影響著細(xì)胞的生死存亡。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)，會(huì)導(dǎo)致線粒體受到損傷。引起線粒體膜電位降低，甚至線粒體外膜破裂，釋放多種細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白，如細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis-Inducing Factor,AIF)等。從而誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡或壞死途徑。發(fā)生缺血缺氧時(shí)，線粒體首先受到損

4、傷，導(dǎo)致線粒體功能紊亂。通過線粒體自噬，清除了功能紊亂的線粒體，同時(shí)減少了由功能異常的線粒體產(chǎn)生的活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)以及誘導(dǎo)凋亡或壞死的信號(hào)分子的釋放。最近有研究表明，MB在神經(jīng)退行性疾病阿爾茲海默氏病中表現(xiàn)出提高自噬分子LC3-Ⅱ的表達(dá)量、降低自噬連接蛋白p62水平的作用。推測MB可能通過促進(jìn)自噬，起到神經(jīng)保護(hù)的作用。MB可能是潛在的自噬促進(jìn)劑。
　　到目前為止，僅有四篇MB顯著減少

5、腦梗死體積的報(bào)道，其中三篇都是心臟驟停復(fù)蘇引發(fā)的全腦缺血再灌損傷。只有一篇應(yīng)用大腦中動(dòng)脈閉塞(MiddleCerebral Artery Occlusion，MCAO)模型對腦缺血再灌進(jìn)行的研究。腦缺血再灌損傷和永久性腦缺血存在不同的發(fā)病機(jī)制。然而，目前尚無MB是否對永久性腦缺血具有保護(hù)作用的研究。
　　本研究采用大鼠永久性腦缺血(permanent Middle Cerebral Artery Occlusion，pMCAO)模

6、型模擬永久性缺血性腦卒中。首先觀察了MB對于大鼠永久性腦缺血的保護(hù)性作用，之后在低氧敏感神經(jīng)元樣細(xì)胞PC12上構(gòu)建細(xì)胞氧糖剝奪(Oxygen Glucose Deprivation，OGD)模型，模擬腦缺血。進(jìn)一步確認(rèn)了MB的腦保護(hù)作用，并揭示了其可能的作用機(jī)制。本研究表明MB能夠改善腦缺血24h所致的神經(jīng)功能障礙，減少腦梗死體積與細(xì)胞壞死，引起線粒體自噬的發(fā)生，緩解了線粒體和細(xì)胞形態(tài)的惡化。在細(xì)胞水平，我們證實(shí)MB能維持OGD條件下的

7、線粒體膜電位(Mitochondrial Membrane Potential，MMP，△Ψm)，增加線粒體自噬，減少ROS的生成。進(jìn)一步證明MB是通過引起線粒體自噬，起到對缺血腦組織的保護(hù)作用的。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1.MB對永久性腦缺血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用
　　1.1 MB緩解了pMCAO大鼠神經(jīng)功能缺損
　　采取三種方法:Longa評分法、爬格實(shí)驗(yàn)、姿勢反射與肢體放置測驗(yàn)對pMCAO大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行

8、評價(jià)。在術(shù)后24h，與對照組(VC組)相比，亞甲藍(lán)的低劑量組（L組），中劑量組（M組），高劑量組（H組）三組大鼠神經(jīng)功能顯著改善，其中以MB中劑量組(5mg/kg)效果最為顯著。
　　1.2 MB顯著減少pMCAO大鼠腦梗死體積
　　采用TTC染色判斷腦梗死體積變化。在我們的實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組（S組）大鼠腦組織未見到梗死區(qū)域，由大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血24h后，VC組大鼠出現(xiàn)了明顯的腦梗死灶。M組大鼠與VC組相比，腦梗死體積顯著

9、降低約26％，L組、H組也出現(xiàn)了同樣的治療效果。
　　1.3 應(yīng)用MB治療，大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)得到改善，腫脹細(xì)胞率顯著降低
　　應(yīng)用HE染色，光鏡觀察大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化。缺血24h后，VC組大鼠腦組織缺血灶區(qū)域細(xì)胞排列疏松、散亂，細(xì)胞間隙增大。細(xì)胞腫脹，著色變淺，細(xì)胞核染色不清，部分胞體皺縮，細(xì)胞空泡化。與VC組相比，MB的三個(gè)劑量組細(xì)胞形態(tài)的惡化得到緩解，腫脹細(xì)胞率顯著降低。
　　1.4 MB顯著減少了p

10、MCAO大鼠腦組織壞死神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量
　　凋亡和壞死是腦缺血損傷后細(xì)胞死亡的主要形式。應(yīng)用Fluoro-Jade B(FJB)和TUNEL雙重?zé)晒馊旧夹g(shù)，我們發(fā)現(xiàn)腦缺血24h后神經(jīng)細(xì)胞壞死數(shù)量顯著增加，與VC組相比，MB的三個(gè)劑量組壞死神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量均顯著降低。
　　1.5 MB下調(diào)了pMCAO大鼠腦組織壞死相關(guān)分子RIP1和RIP3的表達(dá)
　　RIP1和RIP3是目前已知的程序性壞死的關(guān)鍵信號(hào)分子。應(yīng)用western

11、 blot技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)，與對側(cè)（未損傷側(cè)）相比，缺血側(cè)（損傷側(cè)）RIP1和RIP3蛋白表達(dá)顯著升高，而中劑量MB抑制了RIP1和RIP3蛋白表達(dá)的上調(diào)。提示MB可能對pMCAO大鼠腦組織壞死有對抗作用。
　　2.MB對永久性腦缺血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制
　　2.1 MB促進(jìn)了線粒體自噬，改善了線粒體形態(tài)
　　Beclin1、LC3、p62和Tom20是線粒體自噬的重要相關(guān)分子，我們通過western blot技術(shù)對其

12、含量表達(dá)變化進(jìn)行了檢測。與對照側(cè)相比，VC組缺血側(cè)Beclin1的表達(dá)顯著降低，LC3-Ⅱ/Ⅰ比例降低，p62和Tom20表達(dá)上調(diào)。而應(yīng)用MB治療后，無論是在缺血側(cè)還是對照側(cè)大腦半球，與VC組相比，MB都促進(jìn)了MCAO大鼠腦組織線粒體自噬的發(fā)生。
　　借助透射電子顯微鏡，在MB治療組大鼠腦組織細(xì)胞中我們觀察到典型的線粒體自噬體。腦卒中后24h大鼠腦組織皮層神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的線粒體損傷。線粒體嵴紊亂、斷裂，線粒體的基質(zhì)顆粒大量消失，線

13、粒體空泡化。而在MB的三個(gè)治療組，神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)得到明顯改善。通過線粒體評分的比較，我們發(fā)現(xiàn)中劑量MB的神經(jīng)保護(hù)作用最為顯著。這些結(jié)果提示，MB可能是通過增加線粒體自噬的發(fā)生來保證腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞線粒體質(zhì)量的。
　　2.2 MB通過促進(jìn)線粒體自噬，減少了腦缺血損傷
　　我們構(gòu)建了PC12的OGD模型，經(jīng)western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在OGD2h后，MB促進(jìn)了Beclin1表達(dá)上調(diào)，LC3-Ⅱ/Ⅰ比例升高以及p62和Tom2

14、0表達(dá)降低，這些都證明MB具有促進(jìn)自噬發(fā)生的作用。
　　為了驗(yàn)證MB是否是通過增加線粒體自噬來起到對腦缺血損傷的保護(hù)性作用的，我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測了自噬抑制劑3-MA對ROS含量變化的影響。我們發(fā)現(xiàn)OGD的發(fā)生引起ROS的爆發(fā)式增加，而MB的使用顯著抑制了該現(xiàn)象的出現(xiàn)。但當(dāng)同時(shí)使用自噬抑制劑3-MA時(shí)，MB的保護(hù)作用被抑制。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明，MB在OGD下促進(jìn)線粒體自噬發(fā)生，減少了ROS的生成，起到保護(hù)作用。
　　2.3

15、MB阻止了OGD引起的△Ψm降低，增加了線粒體自噬的發(fā)生
　　實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PC12細(xì)胞經(jīng)OGD處理2h，△Ψm陡然降低，MB減緩了這一趨勢的發(fā)生，然而在常氧狀態(tài)下，MB也會(huì)導(dǎo)致△Ψm的降低。我們進(jìn)一步驗(yàn)證了MB是否是通過對△Ψm的影響來增加線粒體自噬。在實(shí)驗(yàn)中加入解耦連劑羰基氰化物間氯苯腙(Carbonyl Cyanide-m-Chlorophenylhydrazone，CCCP)，檢測線粒體自噬的變化。OGD時(shí)PC12細(xì)胞線粒體自