選擇性激活星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元樹突絲運動的影響.pdf

1、背景和目的:星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元的作用越來越受到重視,已知星形膠質(zhì)細胞可以釋放多種活性物質(zhì)對神經(jīng)元產(chǎn)生、突觸形成以及調(diào)節(jié)突觸傳遞等各種神經(jīng)元功能起重要調(diào)制作用。除了谷氨酸,星形膠質(zhì)細胞還可以釋放D-絲氨酸對神經(jīng)元長時程增強的產(chǎn)生起重要作用以及釋放ATP對神經(jīng)元活動產(chǎn)生異突觸抑制,提示膠質(zhì)細胞可以通過釋放信號分子對突觸功能具有重要調(diào)節(jié)作用。另一方面,樹突棘形態(tài)和活動狀態(tài)與突觸功能密切相關(guān),但有關(guān)星形膠質(zhì)細胞對樹突棘的影響,人們了解很少。最

2、近用雙光子成像技術(shù)的研究顯示,星形膠質(zhì)細胞突起的活動與其鄰近樹突絲的運動密切相關(guān),星形膠質(zhì)細胞的突起通過直接接觸,具有穩(wěn)定樹突絲活動和促進樹突絲的發(fā)育的作用。但星形膠質(zhì)細胞是否可通過釋放信號分子來調(diào)節(jié)樹突絲形態(tài)和運動目前還不清楚。我們的研究目的是建立藍光刺激膠質(zhì)細胞(表達光敏感通道ChR2)對神經(jīng)元樹突絲形態(tài)及運動檢測的模型,實現(xiàn)選擇性激活星形膠質(zhì)細胞,研究星形膠質(zhì)細胞興奮對神經(jīng)元樹突絲運動的影響及其可能的分子調(diào)節(jié)機制。
　　

3、實驗方法:原代培養(yǎng)SD大鼠的星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞,并建立星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的混合培養(yǎng)模型。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將光敏感通道(Channelrhodopsin2)轉(zhuǎn)入原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞中,當(dāng)Channelrhodopsin2在細胞膜表面表達后,用470mm藍色脈沖光(刺激模式為1Hz,800ms open,200msclosed,10次/串)照射星形膠質(zhì)細胞,并用激光共聚焦顯微鏡觀察星形膠質(zhì)細胞的活動(以鈣波為活動信號)。采用電

4、轉(zhuǎn)方法將熒光蛋白GFP轉(zhuǎn)入神經(jīng)元細胞,并用激光共聚焦顯微鏡觀察第4～5天神經(jīng)元細胞樹突絲的形態(tài)和運動,同時給予100μMATP或100μM谷氨酸,觀察ATP或谷氨酸對神經(jīng)元樹突絲的形態(tài)和運動的影響。對混合培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞給予上述模式的光刺激,同樣激光共聚焦顯微鏡觀察混合培養(yǎng)的第4～5天的神經(jīng)元細胞樹突絲的形態(tài)和運動。最后用Metamorph軟件對ATP、谷氨酸或光刺激混合培養(yǎng)中星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元樹突絲形態(tài)和運動的影響做定量分析。

5、r>　　 結(jié)果:1.Channelrhodopsin2可以穩(wěn)定表達在星形膠質(zhì)細胞膜表面,并可維持一周左右的時間。我們對激活星形膠質(zhì)細胞的光刺激模式進行摸索,發(fā)現(xiàn)模式為1Hz,800ms open,200ms closed,10次/串時對星形膠質(zhì)細胞有較好的激活作用。星形膠質(zhì)細胞表現(xiàn)出不同程度的鈣波,大致分為四種情況:單次短時程鈣波,多次短時程鈣波,單次長時程鈣波,多次即時鈣波。2.在單獨培養(yǎng)的情況下,100μM的ATP或100μM谷氨

6、酸可以抑制處于體外培養(yǎng)第4～5天的神經(jīng)元樹突絲的運動,給藥前后有顯著性差異。3.在混合培養(yǎng)的模型中,用光刺激器選擇性激活星形膠質(zhì)細胞后,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元樹突絲的運動同樣被抑制,定量分析顯示有顯著性差異。
　　 結(jié)論:Channelrhodopsin2可以穩(wěn)定表達在星形膠質(zhì)細胞膜表面,運用光刺激可以選擇性激活混合培養(yǎng)中的星形膠質(zhì)細胞。星形膠質(zhì)細胞的興奮可以抑制神經(jīng)元樹突絲的運動,效果與100μMATP或100μM谷氨酸類似。這表明星形膠