骨骺損傷畸形愈合分子機制及預(yù)防方法的初步研究.pdf

1、第一部分:大鼠脛骨近端骨骺損傷后骨橋形成的分子機制
　　目的：利用脛骨近端干骺端骨骺損傷的大鼠動物模型，研究骨橋形成的分子病理機制。方法：通過AlcianBlue染色觀察損傷模型的建立、損傷愈合過程以及骨橋形成情況。采用Tunel試劑盒進行原位細胞凋亡檢測，了解損傷區(qū)及周圍細胞凋亡情況。采用BrdU抗體檢測BrdU標記的增殖細胞，明確損傷區(qū)周圍軟骨細胞增殖活性是否發(fā)生改變。利用免疫組織化學(xué)方法、原位雜交實驗，觀察損傷區(qū)周圍肥大區(qū)軟

2、骨細胞是否改變，檢測損傷區(qū)是否有軟骨細胞生成，并確定損傷周邊軟骨細胞是否存活，檢測Ihh表達以及Ptch1表達陽性細胞，損傷區(qū)是否有其表達，及周圍未損傷軟骨是否正常表達。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)在骨骺損傷后骨橋形成過程中，在完全損傷區(qū)中心沒有軟骨細胞特異的因子ColⅡ和ColX以及IndianHedgehog（Ihh）和Ptch1的表達，沒有軟骨細胞增殖，但是發(fā)現(xiàn)完全損傷區(qū)和周圍正常軟骨交屆間存在次損傷軟骨區(qū)，存在軟骨細胞凋亡，有ColX的表達，Br

3、dU和Vimentin檢測發(fā)現(xiàn)在此區(qū)和周圍正常軟骨間由正常肥大區(qū)軟骨細胞異常增殖、分化而來的成纖維樣細胞形成軟骨外膜樣結(jié)構(gòu)，次損傷區(qū)和軟骨外膜結(jié)構(gòu)逐漸被骨橋替代，在此過程中軟骨外膜樣結(jié)構(gòu)存在Col1、Ptch1和Ihh的表達，提示由軟骨細胞分泌的促成骨生成有關(guān)的生長因子Ihh可能參與骨橋形成過程。結(jié)論：提出骨橋形成是由兩種成骨機制共同參與的結(jié)果，在此過程中損傷中心區(qū)域存在膜內(nèi)化骨機制，邊緣區(qū)域存在軟骨化骨作用機制。
　　第二部分：

4、大鼠脛骨近端骨骺損傷后預(yù)防骨橋形成的方法
　　目的：利用脛骨近端干骺端骨骺損傷的大鼠動物模型，通過比較不同方法修復(fù)生長板損傷的治療效果，評價纖維蛋白膠材料應(yīng)用于微創(chuàng)治療方法的可行性。方法：利用未成熟大鼠制作脛骨近端骨骺損傷模型。通過組織化學(xué)染色觀察損傷模型的建立、損傷愈合過程以及骨橋形成情況。28只大鼠單側(cè)脛骨近端骨骺損傷，右側(cè)損傷側(cè)，左側(cè)正常對照側(cè)。另外28只大鼠脛骨近端骨骺雙側(cè)損傷，左側(cè)植入脂肪，右側(cè)植入纖維蛋白膠。術(shù)后取材先

5、進行顯微CT檢查，再行組織學(xué)檢測。比較纖維蛋白膠、脂肪作為填充材料預(yù)防治療大鼠脛骨近端骨骺損傷后骨橋形成的情況，以及大鼠脛骨長度和近端角度的變化。結(jié)果：術(shù)后16周及24周，纖維蛋白膠和脂肪填充組損傷區(qū)域顯示低密度影混雜高密度影量，單純損傷組損傷區(qū)域顯示明顯骨橋。組織學(xué)檢查顯示，纖維蛋白膠和脂肪填充組損傷區(qū)域逐漸被纖維組織替代，單純損傷組損傷區(qū)域逐漸被骨橋組織替代。纖維蛋白膠填充治療組在控制脛骨近端骨骺損傷后的畸形方面不如脂肪填充治療組，

6、但沒有顯著差異。在避免損傷區(qū)出現(xiàn)不可逆的骨橋方面，與脂肪填充治療組效果接近（p>0.05）。纖維蛋白膠填充組與單純損傷組之間存在明顯差異（p<0.05），脂肪填充組與單純損傷組之間存在非常明顯差異（p<0.01）。結(jié)論：纖維蛋白膠制作來源廣泛，術(shù)中應(yīng)用簡便，效果與傳統(tǒng)的脂肪填充治療接近，因而推測可能作為一種新的生物材料引入臨床，預(yù)防骨骺損傷后的骨橋形成。顯微CT可以用于骨骺損傷后骨橋形成的觀察研究中。
　　第三部分：VEGF對大鼠

7、脛骨近端骨骺損傷骨橋形成的影響
　　目的：觀察VEGF在骨橋形成過程中的作用，研究預(yù)防骨橋形成的新型微創(chuàng)方法的理論基礎(chǔ)。方法：利用未成熟大鼠制作脛骨近端骨骺損傷模型。32只大鼠單側(cè)脛骨近端骨骺損傷，右側(cè)損傷側(cè)，左側(cè)正常對照側(cè)。20只大鼠脛骨近端骨骺雙側(cè)損傷，左側(cè)單純植入anti-VEGF-Flt。術(shù)后取材先進行顯微CT檢查，再行組織學(xué)檢測。利用原位雜交實驗檢測VEGF在損傷區(qū)表達情況。通過組織化學(xué)染色觀察損傷愈合過程以及骨橋形成情

8、況利用顯微CT觀察anti-VEGF-Flt填充后預(yù)防大鼠脛骨近端骨骺損傷后骨橋形成情況，以及大鼠脛骨長度和近端角度的變化。結(jié)果：損傷后第10天在損傷區(qū)開始出現(xiàn)VEGF表達。單純注射anti-VEGF-Flt術(shù)后16周及24周損傷區(qū)域顯示低密度影混雜高密度影量增多并出現(xiàn)骨橋。組織學(xué)檢查顯示，anti-VEGF-Flt組逐漸被纖維組織和骨組織共同充填，單純損傷組損傷區(qū)域逐漸被骨橋組織替代。在避免損傷區(qū)出現(xiàn)不可逆的骨橋和預(yù)防大鼠脛骨骨骺損傷

9、后出現(xiàn)近端畸形方面，anti-VEGF-Flt組在早期有較好抑制效果，后期效果不佳。結(jié)論：VEGF信號途徑參與骨橋的形成，通過抑制VEGF信號可以在早期抑制骨橋形成，但是后期抑制效果減弱。
　　第四部分：anti-VEGF-Flt復(fù)合FS預(yù)防大鼠脛骨近端骨骺損傷的骨橋形成目的：利用VEGF本身的特性和纖維蛋白膠的優(yōu)勢結(jié)合，開發(fā)可注射型修復(fù)材料，建立一種微創(chuàng)生物學(xué)治療方法，研究預(yù)防骨橋形成的可行性及治療效果。方法：利用未成熟大鼠制作

10、脛骨近端骨骺損傷模型。20只大鼠單側(cè)脛骨近端骨骺損傷，右側(cè)損傷側(cè)，左側(cè)正常對照側(cè)。20只大鼠脛骨近端骨骺雙側(cè)損傷，左側(cè)植入脂肪，右側(cè)植入纖維蛋白膠。20只大鼠脛骨近端骨骺雙側(cè)損傷，左側(cè)單純植入anti-VEGF-Flt，右側(cè)植入復(fù)合纖維蛋白膠的anti-VEGF-Flt。術(shù)后取材進行顯微CT檢查。比較復(fù)合纖維蛋白膠的anti-VEGF-Flt、單純anti-VEGF-Flt、纖維蛋白膠、脂肪填充后預(yù)防治療大鼠脛骨近端骨骺損傷后骨橋形成的

11、情況，以及大鼠脛骨長度和近端角度的變化。結(jié)果：在預(yù)防大鼠脛骨骨骺損傷后出現(xiàn)近端畸形方面，雖然在早期的區(qū)別不大，但在后期復(fù)合纖維蛋白膠的anti-VEGF-Flt填充組明顯優(yōu)于單純纖維蛋白膠填充組和單純anti-VEGF-Flt組，且好于脂肪填充組。在避免損傷區(qū)出現(xiàn)不可逆的骨橋方面，復(fù)合纖維蛋白膠的anti-VEGF-Flt填充組與脂肪填充治療組效果無差異（p>0.05），兩者都與單純損傷組之間存在非常明顯差異（p<0.01）。結(jié)論：an