TOB1缺失的MSCs在肩袖損傷腱骨愈合中的作用及機制研究.pdf

1、肌腱-骨交界處損傷修復(fù)后形成的瘢痕組織界面，容易發(fā)生再次斷裂，94％肩袖肌腱修復(fù)后沒有恢復(fù)到腱骨愈合。移植的肌腱和骨之間的瘢痕組織是機械性能弱于本體組織，失敗率高。因此，迫切需要新的修復(fù)策略來改善肩袖腱骨愈合。最近，以骨髓間充質(zhì)干細胞MSCs為基礎(chǔ)的生物治療提供了一種潛在的方法來改善肩袖修復(fù)。Tob1是Tob/B細胞易位基因(BTG)家族的一個成員，Tob1能夠通過負性調(diào)節(jié)BMP/Smad信號通路調(diào)控成骨細胞的增殖和分化。本研究中，我們

2、探討骨髓間充質(zhì)干細胞Tob1缺失對大鼠肩袖損傷修復(fù)模型改善腱骨愈合的影響，Tob1的上游調(diào)控目前沒有報道，miR-218是MSCs中有力的成骨miR，我們進一步研究其可否調(diào)節(jié)Tob1表達和對腱骨愈合的影響。
　　目的:
　　1.探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞MSCs的Tob1基因缺失的生物學特性，為下一步研究腱骨愈合打下基礎(chǔ)。
　　2.探討Tob1基因缺失的大鼠MSCs促進肩袖損傷腱骨愈合影響的研究。
　　3.探討調(diào)控

3、Tob1表達的miRNA的鑒定。
　　4.初步觀察miR-218促進腱骨愈合的體內(nèi)研究，為將來實現(xiàn)臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.利用全骨髓貼壁的方法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞MSCs，重組慢病毒編碼Tob1短發(fā)夾RNA（shRNA）轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，獲得Tob1基因缺失的MSCs穩(wěn)轉(zhuǎn)株(MSCs-shTob1)，Real time RT-PCR和Western b1ot檢測Tob1基因敲除效果，MTT法

4、檢測MSCs-shTob1細胞增殖能力，茜素紅染色檢測MSCs-shTob1成骨分化能力，油紅O染色檢測MSCs-shTob1成脂分化能力，流式細胞技術(shù)檢測MSCs-shTob1細胞表面標志物。
　　2.建立大鼠肩袖損傷重建模型，分為對照組、MSCs組和MSCs-shTob1組，分別混合生物蛋白膠注入重建的腱骨界面，術(shù)后4周、8周取材，通過測定最大載荷和剛度完成生物力學試驗，通過固定后脫鈣、石蠟包埋、切片、HE染色，完成組織學分析

5、，通過實時定量qRT-PCR檢測測定Ⅰ和Ⅱ型膠原蛋白的基因表達，從三個方面評價了骨髓間充質(zhì)干細胞Tob1缺失對大鼠肩袖損傷修復(fù)模型腱骨愈合的影響。
　　3.通過生物信息學實驗以及對相關(guān)基因的檢測，驗證候選miRNA是否對目的靶基因的表達產(chǎn)生影響。miR-218 mimic和miR-218 inhibitor轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞，轉(zhuǎn)染48小時后，收獲細胞進行進一步的分析。通過QRT-PCR檢測miR-218對Tob1 mRNA表達水

6、平檢測，以確定miR-218對Tob1 mRNA的影響，Western Blot檢測miR-218對Tob1蛋白表達水平，以確定miR-218對Tob1蛋白表達的影響。
　　4.miR-218慢病毒載體的構(gòu)建、包裝，轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞，qRT-PCR檢測miR-218的表達水平，Western blot檢測miR-218對Tob1蛋白表達的影響，建立大鼠肩袖損傷重建模型，分為對照組、MSCs組和MSCs+miR-218組，分別混

7、合生物蛋白膠注入重建的腱骨界面，術(shù)后8周取材，通過測定最大載荷和剛度完成生物力學試驗，通過固定后脫鈣、石蠟包埋、切片、HE染色，完成組織學分析，從兩個方面評價了miR-218對大鼠肩袖損傷修復(fù)模型腱骨愈合的影響。
　　結(jié)果:
　　1.重組慢病毒編碼Tob1短發(fā)夾RNA(shRNA)轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，通過RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)感染MSCs后能有效下調(diào)內(nèi)源性Tob1的表達，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Tob1-shR

8、NA組有效地降低了Tob1在骨髓間充質(zhì)干細胞的表達。MTT法檢測細胞活性發(fā)現(xiàn)沉默Tob1顯著增加MSCs的增殖活性。茜素紅染色和油紅O染色發(fā)現(xiàn)MSCs-shTob1仍有成骨、成脂等多向分化潛能，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)高表達間充質(zhì)干細胞表面標志物CD29和CD44，不表達造血干細胞標志物CD34和CD45。表明MSCs-shTob1沒有改變間充質(zhì)干細胞的細胞表型。
　　2.SD大鼠行岡上肌腱切斷和修復(fù)。術(shù)后4周的MSCs-shTob1組

9、最大載荷明顯高于對照組和MSCs組(P＜0.05)，然而三組間的剛度沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。在8周，MSCs-shTob1組最大載荷仍最高(P＜0.05)，并且剛度明顯高于對照組和MSCs組(P＜0.05)。HE染色，術(shù)后4周，對照組顯示腱骨界面主要由成纖維細胞骨之間的松散纖維，無軟骨或膠原纖維。在MSCs組和MSCs-shTob1組，腱骨交界處界面可見少量的軟骨樣細胞。然而三組之間沒有顯著的差異。術(shù)后8周時，對照組膠原纖維稀疏

10、、雜亂的。MSCs組與對照組比，有更多的垂直的膠原纖維相似Sharpey纖維，少量的軟骨細胞。MSCs-shTob1組發(fā)現(xiàn)更多的軟骨細胞和纖維軟骨。軟骨細胞規(guī)整、成串排列。通過實時聚合酶鏈反應(yīng)檢測損傷的肌腱骨連接處Ⅰ、Ⅱ型膠原基因的表達。第4周:MSCs-shTob1組中的Ⅰ型膠原蛋白表達量較對照組和MSCs組有明顯提高;而Ⅱ型膠原蛋白沒明顯變化。第8周:MSCs-shTob1組中的Ⅰ型膠原蛋白和Ⅱ型膠原蛋白都有顯著提高(P＜0.05)

11、。
　　3.通過在線數(shù)據(jù)庫TargetScan6.2與miRanda分析，發(fā)現(xiàn)Tob13'UTR(170-177 bp處)上含有一個保守的miR-218結(jié)合位點，我們克隆了Tob13UTR序列的熒光素酶基因下游，獲得3'Tob1 UTR。熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示miR-218轉(zhuǎn)染后的3'Tob1UTR，相對熒光素酶活性明顯降低。miR-218 mimic和miR-218 inhibitor對Tob1 mRNA無明顯影響，miR

12、-218mimic導致Tob1蛋白明顯下調(diào)，而miR-218 inhibitor抑制劑上調(diào)Tob1蛋白表達。這些結(jié)果提示Tob1是miR-218的直接目標。
　　4.miR-218慢病毒感染MSCs細胞，實時PCR證實高度上調(diào)表達miR-218，而Tob1蛋白水平明顯下調(diào)。SD大鼠行岡上肌腱切斷和修復(fù)。術(shù)后8周，MSCs+miR-218組較對照組和MSCs組最大載荷及剛度均有明顯提高(P＜0.05)，與對照組及MSCs組比較有更多

13、排列更規(guī)整的膠原纖維和軟骨細胞出現(xiàn)(P＜0.05)。可見MSCs+miR-218有更好的促腱骨愈合作用。
　　結(jié)論:
　　本研究顯示骨髓間充質(zhì)干細胞Tob1缺失有效改善了大鼠肩袖損傷修復(fù)模型的腱骨愈合，首次發(fā)現(xiàn)了Tob1的上游調(diào)控因子miR-218，并證明Tob1的表達可被miR-218調(diào)控。過表達miR-218有效促進大鼠模型的腱骨愈合，類似于Tob1缺失的影響。這些發(fā)現(xiàn)為骨髓間充質(zhì)干細胞在提高腱骨愈合中的應(yīng)用提供了理論依