脊髓缺血性損傷和保護(hù)分子機(jī)制的初步實驗研究.pdf

1、第一部分豬脊髓缺血微透析的觀察研究目的：建立豬脊髓微透析的動物模型，觀察豬脊髓神經(jīng)細(xì)胞間液中能量代謝相關(guān)物質(zhì)和各種氨基酸的變化，探討脊髓缺血和再灌注損傷的分子機(jī)制。 方法：本實驗于2003年10月至2004年5月在阜外心血管病醫(yī)院實驗外科完成。6只成年中國小型香豬，首先在腰2段脊髓中植入微透析針，經(jīng)左側(cè)第4肋間開胸，游離降主動脈和左奇靜脈。常溫阻斷主動脈和左奇靜脈60分鐘，開放再灌注90分鐘。術(shù)后即刻取腰2段脊髓行HE染色，觀察

2、動物脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的損傷程度，計算活力指數(shù)。分別于阻斷前、阻斷30分鐘、阻斷60分鐘、開放30分鐘、開放60分鐘和開放90分鐘收集微透析樣本。微透析樣本分別檢測能量代謝相關(guān)物質(zhì)：葡萄糖、丙酮酸、乳酸和甘油：氨基酸：天門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸和?；撬?。觀察不同時間點不同物質(zhì)的變化趨勢。方差分析和非參數(shù)檢驗完成統(tǒng)計分析。 結(jié)果：葡萄糖和丙酮酸的含量在主動脈阻斷后降低，再灌注開始時達(dá)到最低點，此后含量逐漸升高，再灌注90

3、分鐘時未恢復(fù)。乳酸的含量在阻斷后即出現(xiàn)明顯升高，后無下降趨勢。乳酸/丙酮酸比值在再灌注開始時達(dá)到高峰。脊髓神經(jīng)細(xì)胞間液中的天門冬氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸在主動脈阻斷后和再灌注后期出現(xiàn)雙峰升高。谷氨酸和?；撬嵩谠俟嘧㈤_始時升高。病理學(xué)檢查：脊髓內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞明顯損傷。 結(jié)論：豬脊髓缺血微透析的動物模型可以應(yīng)用于損傷機(jī)制和保護(hù)效果評價的研究。興奮性氨基酸在脊髓的缺血損傷中占有重要的地位。再灌注90分鐘時谷氨酸、天門冬氨酸升高，可能與

4、脊髓的再灌注損傷有關(guān)。 第二部分豬奇靜脈逆行灌注脊髓的微透析實驗研究目的：建立豬逆行性灌注脊髓的微透析動物模型。觀察在降主動脈常溫阻斷的過程中，經(jīng)奇靜脈逆行灌注脊髓低溫保護(hù)液的可行性和效果。 方法：12只成年中國小型香豬，隨機(jī)分為低溫鹽水組6只(Hypothermicsalinegroup，S組)和低溫動脈血組6只(Hypothermicarterialbloodgroup,B組)。微透析針固定于腰2段脊髓中。左側(cè)第4肋

5、間開胸，游離降主動脈和左奇靜脈。常溫阻斷降主動脈60分鐘，再灌注90分鐘。在胸降主動脈阻斷的同時經(jīng)左奇靜脈逆行灌注。灌注流速為16.65ml/min。S組灌注低溫(4℃)0.9％氯化鈉溶液；B組灌注低溫(4℃)自體動脈血。術(shù)中監(jiān)測動脈壓、直腸溫度的變化。術(shù)后即刻取腰2段脊髓，觀察神經(jīng)元細(xì)胞的損傷程度，計算活力指數(shù)。分別于阻斷前、阻斷30分鐘、阻斷60分鐘、開放30分鐘、開放60分鐘和開放90分鐘收集微透析樣本。微透析樣本分別檢測能量代謝

6、相關(guān)物質(zhì)和氨基酸。觀察不同時間點檢測物質(zhì)的變化趨勢。本研究的第一部分作為對照組(阻斷組)。用獨立樣本t檢驗、方差分析和非參數(shù)檢驗完成統(tǒng)計分析。 結(jié)果：平均動脈壓組間比較無顯著性差異。兩組再灌注后直腸溫度回升不明顯。S組：葡萄糖和丙酮酸在阻斷中和開放的早期變化不明顯。乳酸和甘油的含量在阻斷后期或開放早期出現(xiàn)升高后迅速降低。乳酸/丙酮酸比值在阻斷后明顯升高，開放主動脈后迅速下降。除甘氨酸的含量在阻斷60分鐘時有所升高外，其它氨基酸無

7、顯著性變化。B組：阻斷后葡萄糖含量降低。丙酮酸的含量變化不明顯，開放后其含量升高較阻斷中明顯。乳酸和甘油在開放后升高。乳酸/丙酮酸比值在阻斷后升高，開放主動脈后下降。天門冬氨酸在阻斷早期升高，甘氨酸在阻斷30分鐘時升高。其它氨基酸無顯著性變化。兩組的脊髓損傷輕于阻斷組，神經(jīng)元細(xì)胞大致正常。神經(jīng)元活力指數(shù)比較，兩組的脊髓損傷程度明顯減輕。 結(jié)論：經(jīng)奇靜脈逆行灌注脊髓在阻斷豬降主動脈時的可行性佳。逆行灌注低溫保護(hù)液可以減輕由于缺血引

8、起的脊髓損傷，降低脊髓缺血時的代謝率，抑制興奮性氨基酸的釋放，保護(hù)機(jī)制與低溫有關(guān)。逆行灌注時機(jī)、流量和灌注液成分尚需進(jìn)一步的研究。 第三部分豬深低溫停循環(huán)脊髓微透析的實驗研究目的：運用微透析技術(shù)觀察豬深低溫停循環(huán)過程中脊髓神經(jīng)細(xì)胞間液中的各種物質(zhì)變化，探討脊髓損傷的分子機(jī)制。 方法：6只成年中國小型香豬，首先在腰2段脊髓中植入微透析針，經(jīng)左側(cè)第4肋間開胸，游離降主動脈，切開心包顯露右心房。經(jīng)右房—主動脈建立體外循環(huán)，并行

9、循環(huán)降溫30分鐘，直腸溫度降至20℃時停循環(huán)60分鐘，復(fù)溫和并行循環(huán)120分鐘。微透析樣本分別于體外循環(huán)前、體外循環(huán)30分鐘、停循環(huán)30分鐘、停循環(huán)60分鐘、復(fù)溫30分鐘、復(fù)溫60分鐘、復(fù)溫90分鐘和復(fù)溫120分鐘采集，并檢測相應(yīng)時間點的氨基酸和能量代謝物質(zhì)含量。術(shù)后即刻取腰2段脊髓行病理切片HE染色，觀察脊髓神經(jīng)元的損傷程度。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計方法同前。 結(jié)果：停循環(huán)期間葡萄糖含量無顯著性變化，復(fù)溫后顯著升高。在停循環(huán)后丙酮酸含量顯著

10、降低，恢復(fù)循環(huán)后含量逐漸升高。在降溫和停循環(huán)期間乳酸含量無顯著性變化，復(fù)溫后逐漸增高。乳酸/丙酮酸比值在停循環(huán)60分鐘時達(dá)到高峰。天門冬氨酸和?；撬嵩趶?fù)溫120分鐘時升高明顯。谷氨酸和γ-氨基丁酸在降溫30分鐘達(dá)到最高峰。甘氨酸在復(fù)溫過程中升高。病理學(xué)檢查：脊髓內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞損傷較輕。活力指數(shù)顯示，脊髓神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度與S組和B組相近。 結(jié)論：在深低溫停循環(huán)過程中，脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的能量代謝被明顯抑制。在復(fù)溫的過程中，能量代謝率有