膿毒癥大鼠JAK-STAT信號(hào)通路活化及其與高遷移率族蛋白B1表達(dá)的關(guān)系.pdf

1、目的:該實(shí)驗(yàn)采用大鼠CLP模型動(dòng)態(tài)觀察膿毒癥動(dòng)物主要臟器JAK/STAT信號(hào)通路的活化情況及對HMGB1 mRNA表達(dá)的影響,初步探討G-菌膿毒癥時(shí)HMGB1誘生的信號(hào)調(diào)控機(jī)制;闡明JAK/STAT信號(hào)通路與HMGB1表達(dá)的相互關(guān)系及其在膿毒癥所致多器官功能損害發(fā)病過程中的作用,旨在為進(jìn)一步探索膿毒癥的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和防治途徑提供新的思路. 方法:雄性Wistar大鼠140只,隨機(jī)分為8組:(1) 正常對照組(n=10),動(dòng)物于麻醉后活殺

2、;(2) 假手術(shù)對照組(n=10),動(dòng)物于開關(guān)腹腔手術(shù)后2h活殺;(3)盲腸結(jié)扎穿孔組 (n=60):按時(shí)間點(diǎn)分別于CLP后0.5、2、6、12、24和48h活殺動(dòng)物; (4) AG490 (JAK2激酶抑制劑)組(n=24):CLP前20mins皮下注射AG490 8.0 mg/kg,然后于CLP后2、6、24和48h活殺;(5) RPM(rapamycin,STAT抑制劑)組(n=24):CLP前20mins皮下注射注射RPM 0.

3、4 mg /kg,并于CLP后2、6、24和48h活殺.(6) DMSO(二甲基亞砜,試劑的溶質(zhì))組(n=12):開關(guān)腹腔手術(shù)前20mins皮下注射DMSO 4.0 ml/kg,于開關(guān)腹腔術(shù)后2和24h活殺.經(jīng)腹主動(dòng)脈采血,分離血標(biāo)本用于測定血清生化指標(biāo).無菌留取動(dòng)物肝、肺、腎、腸組織進(jìn)行STAT1、STAT3活化分析以及HMGB1mRNA表達(dá)的檢測.STAT活化檢測采用凝膠電泳阻滯分析試驗(yàn);組織HMGB1mRNA表達(dá)采用半定量RT-P

4、CR方法檢測.血清ALT、AST、BUN、Cr等使用7170自動(dòng)生化分析儀測定;肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性采用酶學(xué)分光光度法測定;小腸組織二胺氧化酶(DAO)活性采用分光光度法測定.結(jié)果:1. CLP大鼠STAT1、STAT3活化規(guī)律及AG490、RPM預(yù)處理對CLP大鼠STAT1、STAT3的影響:正常肝、肺、腸、腎組織中STAT1 和STAT3幾乎未見或僅有微弱活化,假手術(shù)組和DMSO組各組織STAT1 和STAT3只有較弱的

5、活化,但與正常對照組相比差別不明顯.肝、肺、腸、腎組織中STAT1在膿毒癥早期即開始活化,CLP后6~24h活化達(dá)到高峰.肝、肺組織中的STAT3的活化特點(diǎn)與STAT1相似,但相對較弱;而在腎、腸組織中未觀察到STAT3的活化.AG490和RPM對肝、肺、腸組織中6h、24h、48h等時(shí)間點(diǎn)STAT1、STAT3活化均有不同程度的抑制作用;AG490對48h腎組織STAT1活化具有一定抑制效應(yīng).2. ①CLP大鼠肝、肺、腸、腎組織HMG

6、B1 mRNA表達(dá)的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn):正常對照組大鼠肝、肺、腸、腎組織中均有一定量的HMGB1 mRNA表達(dá),假手術(shù)后2h表達(dá)無明顯改變.肝組織CLP后6h表達(dá)明顯上調(diào),至48h仍持續(xù)在較高水平;CLP后肺組織HMGB1 mRNA表達(dá)迅速增強(qiáng),2h達(dá)峰值,48h則降至正常對照水平;腸組織HMGB1 mRNA在早期無明顯變化,一直到48h才顯著升高;腎組織HMGB1 mRNA表達(dá)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)與上述三種組織不同,整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察過程中HMGB1 mRN

7、A表達(dá)改變不明顯.②AG490預(yù)處理對CLP大鼠組織HMGB1 mRNA表達(dá)的影響:與膿毒癥組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比,AG490處理后肝組織在24h、48h HMGB1 mRNA表達(dá)顯著降低,肺組織HMGB1 mRNA水平僅在2h時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)為明顯下降;腸組織HMGB1 mRNA表達(dá)早期無明顯變化,24h、48h 顯著下調(diào);AG490處理對腎組織無影響.③RPM預(yù)處理對組織HMGB1 mRNA表達(dá)的影響:與膿毒癥組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比,RPM處理后肝組

8、織在6h、24h HMGB1 mRNA表達(dá)顯著降低,肺組織HMGB1 mRNA水平在2h、6h、24h、48h均表現(xiàn)為明顯下降;腸組織HMGB1 mRNA水平早期影響不大,CLP后24h、48h 則顯著降低.RPM處理對腎組織無影響.3. CLP大鼠肝、腎功能生化指標(biāo)的變化特點(diǎn): ①血清ALT在CLP后24h顯著高于正常對照組,其它時(shí)間點(diǎn)與正常對照相比無顯著差異;AST在CLP后6h開始顯著升高,24h達(dá)峰值,48h仍持續(xù)在高水平.BU

9、N的變化呈現(xiàn)出一定的波動(dòng)性,其中6h、24h、48h顯著高于正常對照組;Cr僅在24h顯著高于正常對照組.②AG490對生化指標(biāo)的影響:AG490處理后,與膿毒癥組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比,血清ALT 24h顯著降低,AST 24h、48h均顯著降低;BUN、Cr均在24h顯著降低.③RPM預(yù)處理對生化指標(biāo)的影響:RPM處理后,與膿毒癥組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比,ALT 24h、48h顯著降低,AST只在48h顯著降低;Cr 、BUN分別于24h、 48h

10、顯著降低. 4. CLP大鼠肺MPO活性變化的及AG490、RPM干預(yù)的影響:CLP大鼠肺MPO活性從2h開始明顯升高,24h達(dá)高峰,48h仍處于較高水平.AG490、RPM預(yù)處理均導(dǎo)致肺組織24、48h MPO活性顯著降低.5. CLP大鼠腸DAO含量的變化及AG490、RPM干預(yù)的影響:CLP后大鼠DAO含量在0.5h和24h顯著低于正常對照和假手術(shù)組,AG490、RPM預(yù)處理對腸DAO含量無明顯影響.結(jié)論: 1. 嚴(yán)重腹腔感染可導(dǎo)

11、致機(jī)體主要臟器JAK/STAT通路迅速活化,其中STAT1在肝、肺、腎、腸組織中廣泛活化,STAT3僅在肝、肺組織中活化明顯,肝、肺組織中STAT1活化強(qiáng)度明顯高于STAT3.初步提示體內(nèi)重要器官JAK/STAT通路的廣泛活化可能參與了膿毒癥的病理生理過程.2.嚴(yán)重腹腔感染可明顯上調(diào)膿毒癥動(dòng)物機(jī)體肝、肺、腸組織"晚期"介質(zhì)——HMGB1 mRNA表達(dá),局部組織HMGB1 基因持續(xù)表達(dá)與感染后多器官功能損害的發(fā)病過程有關(guān).3. 阻斷JAK