GAS下調(diào)巨噬細(xì)胞炎癥因子的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：A族鏈球菌（GAS，又稱為化膿性鏈球菌）可以引起多種人類疾病，最常見的GAS感染是上呼吸道感染，引發(fā)咽炎。盡管咽部感染是自限性的，但如果未徹底治愈，可能發(fā)生急性腎小球腎炎、急性風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性心臟病等感染后遺癥；有時(shí)，GAS感染還會(huì)引起嚴(yán)重的侵襲性疾病，如鏈球菌毒性休克綜合癥，壞死性筋膜炎等。GAS感染的結(jié)果及其嚴(yán)重程度可能依賴于宿主固有免疫機(jī)制控制細(xì)菌的生長(zhǎng)和限制感染部位的病原體進(jìn)一步擴(kuò)散的能力。巨噬細(xì)胞是啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答的主要力

2、量，并啟動(dòng)稍后的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。而且，宿主對(duì)GAS反應(yīng)的有關(guān)資料也顯示在鼠感染模型中定居巨噬細(xì)胞在控制GAS感染中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞能夠識(shí)別、吞噬和破壞GAS以清除入侵的病原體，而其產(chǎn)生的細(xì)胞因子，趨化因子對(duì)于控制感染部位的炎癥細(xì)胞的招募和活化至關(guān)重要。因此，在GAS感染期間巨噬細(xì)胞的功能性活化可能大大影響了致病過(guò)程的特征、進(jìn)程和轉(zhuǎn)歸。
　　 但是，GAS同時(shí)也進(jìn)化出多種策略以克服宿主的免疫反應(yīng)。資料顯示，一個(gè)常見的現(xiàn)象是

3、在嚴(yán)重壞死的GAS感染部位的一線防御細(xì)胞數(shù)量極少。而且，在體內(nèi)的感染模型中，GAS的M蛋白是已知的誘導(dǎo)炎癥的主要力量，當(dāng)其及其它毒力因子被單核細(xì)胞表面的PRR識(shí)別后可以觸發(fā)多種細(xì)胞因子的分泌，包括IL-6，IL-1β，TNF-α，TGF-β等。值得一提的是，產(chǎn)生的細(xì)胞因子不但可以誘導(dǎo)炎癥可能還會(huì)影響鏈球菌的侵襲等機(jī)制。例如，GAS介導(dǎo)產(chǎn)生的TGF-β被發(fā)現(xiàn)可以上調(diào)整合素α5的表達(dá)，即，GAS通過(guò)操控宿主細(xì)胞因子的產(chǎn)生，提高靶受體的表達(dá)水

4、平，進(jìn)而促進(jìn)其與宿主細(xì)胞的粘附和內(nèi)化。除此之外，GAS誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子還可以通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面的死亡受體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。這種誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或凋亡的能力可能對(duì)細(xì)菌有利，使其逃避吞噬活性或損傷宿主組織，進(jìn)而促進(jìn)其向更深部位浸潤(rùn)和播散。
　　 本研究旨在進(jìn)一步了解有利于GAS適應(yīng)生存和持續(xù)感染狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞對(duì)GAS的復(fù)雜反應(yīng)，及GAS逃避巨噬細(xì)胞攻擊的策略，從而進(jìn)一步探索GAS的致病機(jī)制，因此，擬采取以下實(shí)驗(yàn)：1、蛋白芯片檢測(cè)巨噬細(xì)

5、胞受GAS感染后其產(chǎn)生的細(xì)胞因子的表達(dá)譜，利用Real-time PCR驗(yàn)證并動(dòng)態(tài)分析細(xì)胞因子的表達(dá)，以大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(SA)分別作為G-和G+菌感染巨噬細(xì)胞之對(duì)照。2、以炎癥網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)者IL-6為靶點(diǎn)，行In-cell western、ELISA、western blot以了解IL-6的動(dòng)態(tài)變化及其特異性核轉(zhuǎn)錄因子亞基C/EBPβ的活化。3、流式細(xì)胞術(shù)、Real-time PCR、Western blot檢測(cè)

6、細(xì)菌作用下巨噬細(xì)胞的TLRs、MyD88、NF-κB，初步了解細(xì)菌作用下巨噬細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。4、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證體內(nèi)是否與體外細(xì)胞水平結(jié)果一致。以期為研究GAS的致病機(jī)制和免疫治療提供新視角。
　　 方法：
　　 1.蛋白芯片分別檢測(cè)鼠腹腔巨噬細(xì)胞和鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7受到GAS感染后三天炎癥相關(guān)因子及趨化因子的表達(dá)譜，同時(shí)以E.coli和SA分別作為G-和G+菌感染巨噬細(xì)胞之對(duì)照。
　　 2.Real-

7、time PCR驗(yàn)證GAS/SA/E.coli刺激巨噬細(xì)胞后產(chǎn)生的炎癥相關(guān)因子(如IL-6，IL-iβ，TNF-α)和趨化因子(如MCP-1，Rantes，GRO-α)的動(dòng)態(tài)變化。
　　 4.RAW264.7細(xì)胞、BLAB/c小鼠分別接受GAS/SA/E.coli刺激后三天，流式細(xì)胞術(shù)分析RAW264.7細(xì)胞和鼠腹腔巨噬細(xì)胞膜表面TLR的表達(dá)。
　　 5.Real-time PCR檢測(cè)鼠腹腔巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞

8、受到GAS/SA/E.coli刺激后TLR胞內(nèi)段接頭蛋白MyD88的表達(dá)差異。
　　 6.Western blot檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞受到GAS/SA/E.coli刺激后核轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.蛋白芯片結(jié)果顯示，RAW264.7細(xì)胞受到GAS/SA/E.coli感染后3天表達(dá)的炎癥相關(guān)分子中與正常比較表達(dá)差異最大的為TNF-α(Ratio:6.07);BLC(Ratio:4

9、.2),IL-1α(Ratio:2.85),Rantes(Ratio:2.68),MCP-1(2.17),LIX(Ratio:1.98),G-CSF(Ratio:1.88),IL-6(Ratio:1.71),M-CSF（Ratio:1.59），及IL-1β(Ratio:1.55)的表達(dá)量依次次之。鼠腹腔巨噬細(xì)胞受到GAS/SA/E.coli感染后3天的蛋白芯片結(jié)果顯示與正常比較表達(dá)差異最大的為BLC(Ratio:5.0)的表達(dá)量最高，K

10、C(Ratio:4.49)，IL-1α(Ratio:4.3),TNF-α(2.49),LIX(Ratio:2.25),M-CSF(1.93),IL-1β(1.69)，IL-6(1.5)的表達(dá)量依次次之；
　　 2.RAW264.7細(xì)胞受GAS/SA/E.coli刺激后產(chǎn)生的細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)分析顯示在2小時(shí)之內(nèi)高表達(dá)的主要細(xì)胞因子為GRO-α，IL-iβ及TNF-α。在2小時(shí)候后高表達(dá)的主要細(xì)胞因子為IL-1β，IL-6，IL-12

11、，MCP-1及IL-10;在對(duì)鼠腹腔巨噬細(xì)胞受GAS/SA/E.coli刺激后的細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)分析顯示在2小時(shí)內(nèi)高表達(dá)的主要細(xì)胞因子為GRO-α，IL-23，TNF-α，Rantes。在2小時(shí)后高表達(dá)的主要細(xì)胞因子為GRO-α，IL-iβ，IL-12，MCP-1，MIP-1α。
　　 3.無(wú)論是鼠腹腔巨噬細(xì)胞還是RAW264.7細(xì)胞受到GAS刺激后所分泌的細(xì)胞因子水平絕大部分較SA和E.coli刺激組低，除了抑制因子IL-10和

12、TGF-β外；其中，在RAW264.7細(xì)胞中，IL-10的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SA刺激組和E．coli刺激組。而在鼠巨噬細(xì)胞中，抑制因子TGF-β的水平占了優(yōu)勢(shì)，盡管SA刺激組也表達(dá)了高水平的TGF-β。
　　 從細(xì)胞因子分泌動(dòng)態(tài)角度，無(wú)論是鼠腹腔巨噬細(xì)胞還是RAW264.7細(xì)胞在受到E.coli刺激后產(chǎn)生的細(xì)胞因子大多數(shù)在1天內(nèi)達(dá)到最高水平；而該細(xì)胞受GAS和SA刺激后產(chǎn)生的細(xì)胞因子大多數(shù)在1天后達(dá)到最高水平。
　　 4.TL

13、R受體的表達(dá)：
　　 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果及實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果均顯示：TLR2:在GAS刺激組和SA刺激組的無(wú)論是鼠腹腔巨噬細(xì)胞還是RAW264.7細(xì)胞表面的TLR2的水平均高于PBS組，且差異具有顯著性，而盡管E.coli組的TLR2的水平略高于PBS組，但二者沒(méi)有顯著差異。TLR4:RAW264.7細(xì)胞及鼠腹腔巨噬細(xì)胞在受到GAS/SA/E.coli刺激后，TLR4的水平均高于PBS組，三組之間無(wú)顯著差異。
　　 5.膜受

14、體接頭蛋白MyD88的水平：在感染的2小時(shí)內(nèi)，在鼠腹腔巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中三組的MyD88的水平均高于PBS組，三組間無(wú)顯著差異；盡管細(xì)菌作用的三組RAW264.7細(xì)胞與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異。
　　 6.核轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)菌作用下的狀況：
　　 NF-kB:RAW264.7細(xì)胞受GAS刺激后，核內(nèi)的NF-kBp65逐漸增多，而SA刺激該細(xì)胞后核內(nèi)的NF-kBp65始終都處于高水平，但E.coli刺激該細(xì)胞后核內(nèi)的NF-kBp65的

15、水平最低，且逐漸減少。EMSA檢測(cè)結(jié)果顯示：GAS刺激組的RAW264.7細(xì)胞核內(nèi)的NF-kB主要在刺激1d后達(dá)到高水平狀態(tài)，而SA刺激后的2h～1d的時(shí)段核內(nèi)的NF-kB都處于高水平狀態(tài)，尤其是6小時(shí)時(shí)最明顯。E.coli刺激后的RAW264.7細(xì)胞核內(nèi)的NF-kBp65的水平最低，僅在刺激后的2h～6h時(shí)檢測(cè)到少量NF-kB，這與上述的Western blot結(jié)果一致。
　　 C/EBPβ：RAW264.7接受菌刺激后，We

16、stern blot結(jié)果顯示G+菌GAS、SA的信號(hào)強(qiáng)度高于E.coli及正常對(duì)照，這與上述各種方法檢測(cè)所得G+(包括GAS、SA)誘導(dǎo)該細(xì)胞產(chǎn)生較高水平IL-6結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：
　　 1.GAS/SA/E.coli分別誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞和鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生了不同程度的炎癥因子反應(yīng)。在感染初期巨噬細(xì)胞以分泌募集、活化中性粒細(xì)胞、誘導(dǎo)產(chǎn)生急性期蛋白為主的炎癥因子GRO-α，IL-iβ及TNF-α等；在感染三天

17、后以分泌募集、活化巨噬細(xì)胞、誘導(dǎo)并維持炎癥為主的炎癥因子IL-iβ,IL-6,IL-12,MCP-1等。
　　 2.GAS在體內(nèi)外均誘導(dǎo)鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生遲緩而微弱的炎癥因子反應(yīng)；SA誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生滯后而強(qiáng)烈的炎癥因子反應(yīng)，但卻在體內(nèi)誘導(dǎo)了一個(gè)滯后而較強(qiáng)的炎癥因子反應(yīng)；E.coli無(wú)論是在體內(nèi)還是在體外均誘導(dǎo)鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生迅速而強(qiáng)烈的炎癥因子反應(yīng)，尤其是體內(nèi)感染時(shí)。
　　 3.GAS/SA/E.coli誘導(dǎo)巨噬

18、細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子差異與TLR或TLR4的識(shí)別有關(guān)；E.coli主要誘導(dǎo)TLR4高表達(dá)，GAS與SA均可同時(shí)誘導(dǎo)TLR2和TLR4的高表達(dá)，這可能有利于其與TLR2或TLR4的結(jié)合。
　　 4.接頭蛋白MyD88參與了病原體感染的巨噬細(xì)胞的的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，但與GAS/SA/E.coli誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥因子反應(yīng)的快慢、強(qiáng)弱沒(méi)有必然聯(lián)系?？赡苓€存在其他接頭蛋白參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致NF-kB轉(zhuǎn)位入核的時(shí)間和數(shù)量存在差異