PVL誘導(dǎo)人肺泡巨噬細胞凋亡及其炎癥因子的釋放.pdf

1、目的： MRSA(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus)是引起醫(yī)院內(nèi)感染的常見致病菌，同時CA-MRSA(Community-Associated MRSA)有逐年增高趨勢，已有的流行病學調(diào)查提示PV殺白細胞素(Panton-Valentine Leukocidin，PVL)與CA-MRSA感染相關(guān)，同時醫(yī)院內(nèi)感染株也有攜帶PVL基因的報道，PVL在金葡菌致病機制中的地位有待進一

2、步確定?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)PVL可作用于中性粒細胞，引起膜通透性增加、誘導(dǎo)釋放炎癥因子、誘導(dǎo)壞死或凋亡等，參與壞死性肺炎的發(fā)生。而肺泡巨噬細胞(alveolar macrophages，AMs)作為主要的天然免疫細胞，是抵御肺部微生物感染的第一道防線，誘導(dǎo)其凋亡或壞死使其功能缺失被認為是細菌迷逸免疫的重要機制。PVL對巨噬細胞也具有特異性損害作用，但其對人AMs的總體毒性及其細胞因子分泌的影響尚不清楚。本實驗擬探討PVL對人AMs凋亡及炎癥因

3、子分泌的影響，以了解金葡菌逃逸宿主肺免疫的機制，為葡萄球菌肺炎的免疫治療途徑提供理論依據(jù)。 方法：選取我院2007年10月～2008年4月期間符合入選條件的行纖維支氣管鏡檢查的患者為研究對象，在經(jīng)影像學證實為健側(cè)的右肺中葉(B4或B5)或左肺舌葉行支氣管肺泡灌洗，從灌洗液中分離純化AMs。將分離純化的AMs，按處理因素不同分為正常對照組及不同濃度重組PVL(recombine PVL，rPVL)處理組。通過形態(tài)學觀察、流式細胞儀

4、(Flow Cytometer，F(xiàn)CM)技術(shù)及雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法等，了解PVL對細胞凋亡及細胞因子釋放的影響。 結(jié)果： 1、不同濃度rPVL作用于AMs后呈現(xiàn)典型的生長抑制曲線。 2、相差顯微鏡下見低濃度rPVL組(10nM)細胞變圓，少量細胞漂浮。而高濃度rPVL組(100nM)細胞數(shù)量明顯減少，并見較多失去正常細胞形態(tài)的碎片。 3、倒置相差熒光顯微鏡下觀察Hoechst 33342染色細胞，10

5、nM處理組見凋亡形態(tài)學改變，而100nM組呈壞死樣改變。 4、透射電鏡觀察10nM組見典型凋亡形態(tài)學改變，100nM組見多數(shù)細胞呈壞死樣改變。 5、流式細胞儀技術(shù)定量檢測早期凋亡，發(fā)現(xiàn)低濃度rPVL組(10nM)AMs凋亡陽性細胞率高于對照組，并隨時間延長呈升高趨勢。在早期(6小時)高濃度rPVL組壞死率即高于對照組及低濃度rPVL處理組，隨作用時間延長亦有升高趨勢。高濃度組凋亡陽性細胞率較低濃度組低。 6、不同

6、濃度rPVL早期(2小時)干預(yù)組與空白對照組Rh123平均熒光強度之間差別有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，并隨時間延長呈進行性下降。高濃度組早期Rh123平均熒光強度與低濃度組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。 7、10nM rPVL干預(yù)組與空白對照組培養(yǎng)上清中IL-10的濃度之間差別有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，TNF-α兩組間差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。 結(jié)論：1、rPVL對AMs的細胞毒作用呈濃度

7、依賴性。2、低濃度組：rPVL可引起AMs產(chǎn)生凋亡形態(tài)改變，而高濃度組可產(chǎn)生壞死樣改變。3、rPVL促凋亡作用呈時間依賴性。4、早期(2小時)rPVL即可引起AMs線粒體膜電位明顯下降，并隨時間延長進行性下降。5、rPVL促AMs凋亡的同時，抑炎因子IL-10水平升高，而促炎因子TNF-α水平下降。 總之，rPVL具有促AMs凋亡或壞死效應(yīng)，促其凋亡的同時促炎因子及抑炎因子平衡失調(diào)，上述AMs功能缺失及促炎因子和抑炎因子平衡紊亂