金黃色葡萄球菌殺白細(xì)胞毒素誘導(dǎo)人肺泡巨噬細(xì)胞CD-,14--TLR-,2-及炎癥因子表達(dá)變化.pdf

1、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin Resistant Staphylococcusaureus,MRSA)是醫(yī)院內(nèi)交叉感染的常見致病菌之一，因其對β-內(nèi)酰胺類抗生素的抵抗及萬古霉素療效不佳而成為臨床慢性持續(xù)感染的重要病原體。近年研究發(fā)現(xiàn)社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌肺炎(Community-acquiredMRSA，CA-MRSA)發(fā)病率漸增高，死亡率高，流行病學(xué)調(diào)查傾向認(rèn)為金黃色葡萄球菌殺白細(xì)胞毒素(Panton-

2、Valentine Leukocidin，PVL)與此相關(guān)。醫(yī)院內(nèi)感染株也攜帶PVL基因，且引起重癥肺炎及慢性持續(xù)感染之MRSA菌株中PVL基因陽性率高于社區(qū)獲得性MRSA。研究已發(fā)現(xiàn)PVL作用于多形核中性粒細(xì)胞，形成膜孔道，誘導(dǎo)釋放炎癥因子、細(xì)胞壞死等，參與壞死性肺炎的發(fā)生。人肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages，AMs)作為肺內(nèi)主要的天然免疫細(xì)胞，其通過表達(dá)膜受體CD14、TLR(Toll like recepto

3、r)和分泌炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)免疫功能，誘導(dǎo)其免疫功能下降甚至缺失被認(rèn)為是細(xì)菌逃逸免疫的重要機(jī)制之一。PVL對單核巨噬細(xì)胞也具有特異性損害作用，但其對人AMs的免疫功能損害及其細(xì)胞因子分泌的影響尚不清楚。新近研究傾向于PVL在金葡菌致重癥肺炎及慢性持續(xù)感染中起作用，致病機(jī)制卻有待進(jìn)一步確定。
　　 目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)擬觀察重組PVL(recombinant-PVL,rPVL)對人AMs CD14/TLR2表達(dá)及炎癥因子分泌

4、的影響，以探討PVL(+)金葡菌逃逸宿主免疫引起重癥肺炎或慢性持續(xù)感染的機(jī)制，為葡萄球菌肺炎的治療進(jìn)展提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 基因工程方法提取高純度rPVL。收集我院2008年3月～2008年9月期間符合入選條件行纖維支氣管鏡檢查的患者，于右肺中葉或左肺舌葉行支氣管肺泡灌洗，從灌洗液中分離純化培養(yǎng)AMs。rPVL作用于體外培養(yǎng)之AMs，通過形態(tài)學(xué)觀察、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)及雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，觀察rPV

5、L對AMs細(xì)胞形態(tài)、CD14/TLR2表達(dá)及炎癥因子分泌的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、重組PVL毒素純度高，無內(nèi)毒素污染，具有細(xì)胞毒活性。
　　 2、光學(xué)顯微鏡下見低濃度(10nM)短時(shí)間(6小時(shí))rPVL誘使細(xì)胞呈凋亡改變；而高濃度(100nM)長時(shí)間(24小時(shí))rPVL致細(xì)胞呈壞死性改變。
　　 3、rPVL作用后AMs CD14 mRNA下降，降低幅度隨時(shí)間延長和毒素濃度升高而增加。
　　

6、 4、rPVL長時(shí)間(24小時(shí))作用后AMsTLR2 mRNA上升。
　　 5、rPVL短時(shí)間(6小時(shí))作用于人AMs，高、低濃度均未引起炎癥細(xì)胞因子變化；長時(shí)間(24小時(shí))作用于人AMs，低濃度組IL-10升高而TNF-α降低，高濃度組IL-10和TNF-α均升高。
　　 結(jié)論：
　　 1、rPVL對人AMs有細(xì)胞毒性。
　　 2、rPVL可誘導(dǎo)人AMs凋亡和壞死改變，降低細(xì)胞免疫。
　　 3

7、、rPVL誘導(dǎo)人AMs CD14表達(dá)下降，效應(yīng)呈濃度時(shí)間依賴性，降低細(xì)胞免疫。
　　 4、rPVL長時(shí)間可誘導(dǎo)人AMs TLR2上調(diào)，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
　　 5、rPVL誘導(dǎo)人AMs細(xì)胞因子釋放紊亂，引起細(xì)胞免疫抑制或紊亂。
　　 總之，rPVL促AMs凋亡或壞死，并下降CD14上調(diào)TLR2致兩者表達(dá)分離，抑制其吞噬和免疫反應(yīng)功能。rPVL同時(shí)誘導(dǎo)促炎因子及抑炎因子平衡失調(diào)，引起細(xì)胞因子免疫紊亂，這些綜合效應(yīng)構(gòu)