原花青素B1通過(guò)TLR4-MD2抑制LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng).pdf

1、目的:脂多糖為革蘭氏陰性細(xì)菌最主要的致病物質(zhì)，又稱內(nèi)毒素，其誘發(fā)的一系列機(jī)體炎癥細(xì)胞參與的炎性介質(zhì)釋放鏈級(jí)炎癥反應(yīng)，對(duì)人體組織造成損傷，甚至引發(fā)膿毒癥導(dǎo)致全身多器官功能不全，危機(jī)生命。固有免疫細(xì)胞通過(guò)Toll樣受體(TLRs)對(duì)內(nèi)毒素進(jìn)行識(shí)別，比如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等表面的TLR4在結(jié)合LPS以后即被激活，通過(guò)一系列胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，釋放出以腫瘤壞死因子α(TNF-α)為代表的前炎癥因子。TLR4與LPS并非直接結(jié)合，與前者同時(shí)表達(dá)的髓樣分

2、化蛋白2（MD-2）介于兩者之間，而且MD-2內(nèi)部具有LPS的關(guān)鍵毒性成分——脂質(zhì)A的結(jié)合位點(diǎn)。TLR4下游接頭分子是髓樣細(xì)胞分化因子88(MyD88)，介導(dǎo)非常重要的MyD88依賴性TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路，即包括了NF-κB及MAPK兩條路徑，該通路的激活導(dǎo)致了前炎癥因子釋放，如IL-1β、TNF-α。原花青素(Procyanidin)是一種富含多酚類的化合物，在抗炎免疫方面，其被發(fā)現(xiàn)能夠減低前炎癥因子的分泌。但是原花青素的抗炎機(jī)制目前

3、還不完全清楚，有研究顯示在體外細(xì)胞炎癥模型中，原花青素對(duì)LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的減輕作用與其對(duì)NF-κB及MAPK兩條信號(hào)通路的抑制有關(guān)。為了進(jìn)一步探明原花青素與上游TLR4/MD2復(fù)合受體的關(guān)系，本研究以完全表達(dá)TLR4的人單核細(xì)胞系（THP-1）細(xì)胞為模型，觀察原花青素B1對(duì)LPS介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞TLR4/MD2下游關(guān)鍵接頭分子MyD88以及MD-2的轉(zhuǎn)錄水平的影響。
　　方法:人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1在37℃、5％C

4、O2條件下，用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，細(xì)胞密度維持在5～10×105個(gè)/ml。藥物實(shí)驗(yàn)期間所用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。采用CCK-8法測(cè)藥物的細(xì)胞毒性，將THP-1細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞孵箱預(yù)培養(yǎng)，加入不同濃度的原花青素B110μl（終濃度為50～200μg/ml），加入10μL的CCK-8試劑孵育培養(yǎng)后溶液測(cè)光吸收值(0D)，并且以得到的安全的原花青素B1濃度范圍進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞

5、株建立細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，以ELISA法測(cè)TNF-α的釋放含量，THP-1細(xì)胞接種于96孔板，孵箱預(yù)培養(yǎng)24h，之后以LPS(1μg/ml)加或不加原花青素B1(100μg/ml、50μg/ml)刺激THP-1細(xì)胞，培養(yǎng)18h，分別收集各組細(xì)胞懸液離心后上清液體，與配置好的標(biāo)準(zhǔn)品一起行ELISA檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)品的光吸收值(0D)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而得到各實(shí)驗(yàn)組TNF-α的釋放量水平。沿用LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞株建立細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，借助實(shí)

6、時(shí)定量PCR法分析MyD88mRNA以及MD-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，設(shè)計(jì)合成人MyD88的基因序列、人MD-2的基因序列及內(nèi)參人甘油醛脫氫酶GAPDH的基因序列的引物，THP-1細(xì)胞接種于6孔板中，孵箱預(yù)培養(yǎng)24h，以LPS(1μg/ml)加或不加原花青素B1刺激THP-1細(xì)胞，培養(yǎng)18h。提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總RNA，之后反轉(zhuǎn)錄成cDNA與引物進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，計(jì)算MyD88mRNA及MD-2mRNA相對(duì)定量。
　　結(jié)果:CCK

7、-8測(cè)試藥物毒性的實(shí)驗(yàn)中，原花青素B1濃度不大于100μg/ml的情況下THP-1細(xì)胞活力幾乎不受影響，而當(dāng)原花青素B1濃度在150μg/ml200μg/ml的情況下，THP-1細(xì)胞活力均受到損害。ELISA檢測(cè)TNF-α釋放量實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于陰性對(duì)照組，LPS單獨(dú)刺激組的TNF-α分泌水平明顯升高，表明經(jīng)過(guò)LPS的刺激，THP-1細(xì)胞做出免疫反應(yīng)，經(jīng)過(guò)一系列胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，最終釋放出前炎癥因子。原花青素B1干擾組和LPS單獨(dú)刺激組相比，其腫

8、瘤壞死因子釋放水平明顯降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外，由于原花青素B1干擾的劑量差異，原花青素B1100μg/ml組較原花青素B150μg/ml組所釋放的腫瘤壞死因子α水平更低，且這種差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Real-time PCR檢測(cè)目的基因的實(shí)驗(yàn)中，和陰性對(duì)照組相比，LPS刺激組MyD88mRNA及MD-2mRNA相對(duì)量顯著提高，提示LPS可以顯著上調(diào)THP-1細(xì)胞的MyD88mRNA及MD-2mRNA表達(dá)。而原花青素B1干擾組My

9、D88mRNA及MD-2mRNA相對(duì)量較LPS組顯著下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示原花青素B1對(duì)LPS介導(dǎo)的MyD88mRNA及MD-2mRNA表達(dá)上調(diào)具有抑制作用。
　　結(jié)論:原花青素B1對(duì)于THP-1細(xì)胞具有毒性，而當(dāng)原花青素B1的濃度在100ug/ml及以下時(shí)，細(xì)胞活力不受損害。原花青素B1可明顯降低LPS誘導(dǎo)下THP-1細(xì)胞腫瘤壞死因子α的釋放，并且呈濃度依賴性。原花青素B1這種作用可能其抑制THP-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)時(shí)My