1,25(OH)2D3通過(guò)下調(diào)TLR4介導(dǎo)的炎癥途徑對(duì)DM大鼠心血管的作用.pdf

1、背景：糖尿病(DM)的發(fā)病率逐年增高，DM和其慢性并發(fā)癥已成為威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一。糖尿病心血管并發(fā)癥的防治已成為臨床工作中的重點(diǎn)，對(duì)其的認(rèn)識(shí)已從糖脂代謝紊亂過(guò)渡到免疫和炎癥機(jī)制。研究表明TLR4介導(dǎo)的固有免疫的不適當(dāng)活化和炎癥途徑參與了DM和心血管疾病。維生素D不足是心血管疾病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。除了對(duì)骨代謝的經(jīng)典作用外，1，25(OH)2D3作為不同細(xì)胞類(lèi)型的免疫功能調(diào)節(jié)劑被廣泛認(rèn)可。1，25(OH)2D3能否通過(guò)下調(diào)血管內(nèi)皮

2、細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞TLR4介導(dǎo)的炎癥途徑而發(fā)揮心血管保護(hù)作用，尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。
　　目的：本研究觀察不同劑量的1，25(OH)2D3能否通過(guò)下調(diào)主動(dòng)脈和心臟TLR4介導(dǎo)的炎癥途徑對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心血管發(fā)揮保護(hù)作用。體外實(shí)驗(yàn)觀察1，25(OH)2D3能否通過(guò)此途徑對(duì)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)揮直接作用。
　　方法：采用尾靜脈注射STZ的方法制造DM大鼠模型。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為7組：正常對(duì)照組(C組)、糖尿病未干預(yù)組(D

3、組)、低劑量1，25(OH)2D3組(L組，0.025μg/kg/d)、中劑量1，25(OH)2D3組(M組，0.15μg/kg/d)、高劑量1，25(OH)2D3組(H組，0.3μg/kg/d)、精蛋白鋅胰島素組(Y組，16U/kg/d)及氯沙坦鉀組(A組，10.4mg/kg/d)。成模16周后處死動(dòng)物，留取血、尿標(biāo)本檢測(cè)血糖、血脂、肝腎功能、骨代謝指標(biāo)、C反應(yīng)蛋白和尿微量白蛋白。觀察各組大鼠主動(dòng)脈和心臟的形態(tài)學(xué)變化；應(yīng)用免疫組化和免

4、疫熒光方法檢測(cè)其TLR4、MyD88、NF-κB p65、MCP-1和TRAIL的組織表達(dá)；real-time qPCR和Western blotting方法檢測(cè)其組織的mRNA和蛋白的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)采用低糖(5.5mmol/L)和高糖(25mmol/L)培養(yǎng)基培養(yǎng)A7R5大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，觀察不同濃度和培養(yǎng)時(shí)間的TLR4的表達(dá)水平的變化。選取TLR4表達(dá)量最高的糖濃度和時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用不同濃度的1，25(OH)2D3(1×10-9mo

5、l/L、1×10-8mol/L、1×10-7mol/L)以及氯沙坦鉀(1×10-5mol/L)進(jìn)行干預(yù)。并收集該時(shí)間點(diǎn)的各組細(xì)胞，應(yīng)用real-time qPCR法檢測(cè)TLR4和MyD88的mRNA表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光法和Western blotting法檢測(cè)TLR4和MyD88的蛋白表達(dá)。各組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：1.與D組大鼠相比，中劑量1，25(OH)2D3組的尿鈣升高，但未表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性。2.D組大

6、鼠主動(dòng)脈出現(xiàn)內(nèi)皮粗糙，平滑肌增粗排列紊亂。心肌細(xì)胞可出現(xiàn)變性、壞死。均可出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化。TLR4、MyD88、NF-κB p65、MCP-1和TRAIL在主動(dòng)脈和心臟高表達(dá)。高劑量1，25(OH)2D3、胰島素和氯沙坦鉀能夠改善主動(dòng)脈和心臟的病理表現(xiàn)，能夠下調(diào)TLR4、MyD88、NF-κB p65、MCP-1和TRAIL的組織表達(dá)，中、低劑量1，25(OH)2D3的作用不顯著。3.體外高糖可以誘導(dǎo)VSMC的TLR4表達(dá)，高糖

7、培養(yǎng)VSMC的TLR4表達(dá)在一定范圍內(nèi)存在時(shí)間及濃度依賴(lài)性。1×10-7mol/L的1，25(OH)2D3能夠下調(diào)高糖環(huán)境下VSMC的TLR4及MyD88的表達(dá)。1×10-9mol/L和1×10-8mol/L的1，25(OH)2D3以及氯沙坦鉀作用不顯著。
　　結(jié)論：1.高劑量1，25(OH)2D3治療能夠下調(diào)主動(dòng)脈和心臟TLR4介導(dǎo)的炎癥途徑，降低DM心血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。而中、小劑量1，25(OH)2D3作用不顯著，提示1，25

8、(OH)2D3對(duì)DM心血管的保護(hù)作用需要合適的治療劑量。臨床應(yīng)用應(yīng)最大程度地發(fā)揮骨外的保護(hù)作用，同時(shí)還需要注意監(jiān)測(cè)骨代謝指標(biāo)，對(duì)于可能有影響的患者可考慮應(yīng)用VDR激動(dòng)劑。2.1×10-7mol/L濃度的1，25(OH)2D3能夠抑制高糖環(huán)境下VSMC的TLR4及MyD88的表達(dá)，可以通過(guò)減少下游炎癥因子的表達(dá)，維持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。3.氯沙坦鉀能夠在DM大鼠模型中下調(diào)主動(dòng)脈和心臟TLR4介導(dǎo)的炎癥途徑，而在體外實(shí)驗(yàn)中并未能下調(diào)TLR4