1,25(OH)2D3對PARP1-SIRT1-mTOR通路介導(dǎo)的糖尿病心肌病的保護作用研究.pdf

1、第一部分1,25(OH)2D3對高糖誘導(dǎo)大鼠原代心肌細(xì)胞及H9C2細(xì)胞肥大的干預(yù)作用及機制研究
　　目的：明確高糖誘導(dǎo)大鼠原代心肌細(xì)胞及H9C2細(xì)胞肥大的作用；探討1,25(OH)2D3改善高糖誘導(dǎo)大鼠原代心肌細(xì)胞及H9C2細(xì)胞肥大的最適濃度；明確高糖所致心肌細(xì)胞肥大的作用是否通過多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase, PARP]1。
　　方法：體外培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞及H9C

2、2細(xì)胞系，將細(xì)胞隨機分為5個組，分別用不同濃度葡萄糖（LG：5.5、HG：25mmol/L）、不同濃度1,25(OH)2D3（VD3：10-9、10-8、10-7 mol/L）單獨或聯(lián)合干預(yù)心肌細(xì)胞，Image Pro Plus計算心肌細(xì)胞表面積，RT-PCR檢測心肌肥大標(biāo)志物及PARP1mRNA的表達(dá)，Western blot檢測PARP1蛋白表達(dá)情況。隨后，將細(xì)胞隨機分為4個組：LG、LG+INO1001（PARP1抑制劑）、HG、

3、HG+INO1001，計算各組心肌細(xì)胞表面積，檢測心肌肥大標(biāo)志物及mRNA表達(dá)及PARP1表達(dá)。
　　結(jié)果：葡萄糖濃度為25mmol/L可誘導(dǎo)大鼠原代心肌細(xì)胞及H9C2細(xì)胞表面積增大，心肌肥大標(biāo)志物（β-MHC、ANF、BNP）mRNA表達(dá)升高；1,25(OH)2D3能以劑量依耐性的方式分別抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠原代心肌細(xì)胞及H9C2細(xì)胞肥大；高糖可誘導(dǎo)PARP1表達(dá)升高且高糖所致心肌細(xì)胞肥大與PARP1激活有關(guān)，1,25(OH)2D

4、3能以劑量依耐性的方式抑制高糖引起的PARP1表達(dá)升高。
　　結(jié)論：HG可誘導(dǎo)大鼠原代心肌細(xì)胞及H9C2細(xì)胞肥大，而1,25(OH)2D3呈劑量依賴性的發(fā)揮抗HG致心肌細(xì)胞肥大的作用并能抑制PARP1表達(dá)。
　　第二部分慢病毒轉(zhuǎn)染沉默VDR對H9C2心肌細(xì)胞肥大的影響及作用機制
　　目的：構(gòu)建慢病毒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定沉默VDR的心肌細(xì)胞；探究高糖時VDR沉默對H9C2肥大的影響；明確1,25(OH)2D3的抗H9C2肥大作用是否

5、通過經(jīng)典的VD/VDR途徑，是否與PARP1活性有關(guān)。
　　方法：用Lenti-shVDR感染H9C2，確定最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）并用嘌呤霉素篩選細(xì)胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞。RT-PCR法檢測慢病毒干預(yù)后細(xì)胞VDR mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測VDR蛋白表達(dá)。分別用LG、HG、INO-1001單獨或聯(lián)合干預(yù)穩(wěn)轉(zhuǎn)后的H9C2，檢測心肌細(xì)胞表面積，心肌肥大標(biāo)志物mRNA表達(dá)，以及VDR、PARP1的mRNA及蛋白表

6、達(dá)。
　　結(jié)果：Lenti-shVDR對H9C2細(xì)胞無明顯毒性；MOI為50的lenti-shVDR能夠有效的感染心肌細(xì)胞并可沉默VDR表達(dá)達(dá)70％以上。VDR沉默的H9C2無論是否用HG干預(yù)，較之正常對照組均可發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)表面積增大、心肌肥大指標(biāo)mRNA表達(dá)增高，PARP1蛋白表達(dá)增多，而INO-1001干預(yù)感染Lenti-shVDR的H9C2細(xì)胞后，心肌細(xì)胞表面積無明顯增大、心肌肥大指標(biāo)mRNA表達(dá)無明顯增高，PARP1蛋白表達(dá)

7、降低（均P<0.05）。
　　結(jié)論：Lenti-shVDR可安全有效的感染H9C2并使VDR穩(wěn)定沉默達(dá)70%以上。無論是否有HG環(huán)境，沉默VDR均可引起H9C2細(xì)胞肥大，且其機制與PARP1活化密切相關(guān)。
　　第三部分1,25(OH)2D3對大鼠糖尿病心肌病的干預(yù)作用及其機制研究
　　目的：研究VDR沉默對糖尿病大鼠心臟功能的影響；探討1,25(OH)2D3干預(yù)大鼠糖尿病心肌病的作用及其機制。
　　方法：60只S

8、D大鼠，隨機分為對照組（C組），糖尿病組（DM組），糖尿病+1,25(OH)2D3干預(yù)組（DM+VD3組），糖尿病+Lenti-shVDR組（DM+Lenti-shVDR組），糖尿病+Lenti-shVDR+1,25(OH)2D3干預(yù)組（DM+Lenti-shVDR+VD3組），每組12只。采用單次腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）的方法建立糖尿病大鼠模型，心臟彩超評估心功能，無創(chuàng)鼠尾血壓儀測量血壓，全自動生化儀及ELISA法檢測一般生化指標(biāo)

9、及炎癥因子，HE及天狼星紅染色檢測心肌厚度及間質(zhì)纖維化程度，PCR及（或）Western blot檢測β-MHC、ANF、BNP、VDR、PARP1、SIRT1、TSC2、mTOR、p70s6k的mRNA及（或）蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建大鼠糖尿病心肌病模型及VDR沉默模型。與C組相比，DM組大鼠左室室間隔（LVIVS）、左室后壁（LVPW）厚度和左室舒張/收縮末期內(nèi)徑（LVEDd/s）增大（P<0.05），DM+VD3組

10、上述指標(biāo)顯著改善（P<0.05），而Lenti-shVDR組無論是否用VD3干預(yù)上述指標(biāo)較之對照組均顯著增大（P<0.05），同時心肌肥大指標(biāo)β-MHC、ANF、BNP的mRNA表達(dá)與上述趨勢相同（P<0.05）。此外，膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）和管周膠原面積/官腔面積（PCA/LA）在DM組及Lenti-shVDR組顯著增高（P<0.01），VD3干預(yù)組可顯著降低DM組上述纖維化指標(biāo)，但對VDR沉默組無影響。DM組、DM+Lenti-sh

11、VDR組、DM+Lenti-shVDR+VD3組較之DM+VD3組，PARP1蛋白表達(dá)升高， mTOR和p70S6K磷酸化水平升高，而SIRT1蛋白表達(dá)下降，TSC2磷酸化水平以及循環(huán)血CTRP3水平顯著降低。
　　結(jié)論：STZ單次腹腔注射可成功構(gòu)建糖尿病心肌病大鼠模型；重組慢病毒能安全有效的轉(zhuǎn)染糖尿病大鼠并使之穩(wěn)定沉默VDR。1,25(OH)2D3可通過PARP1/SIRT1/mTOR通路抑制糖尿病心肌肥大和心肌間質(zhì)纖維化進而延