1，25-(OH)-,2-D-,3-對(duì)1型糖尿病的防治作用及其機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病危害嚴(yán)重，與腫瘤、心血管疾病合稱為威脅人類健康的三大殺手。近年來隨著人類飲食結(jié)構(gòu)的變化和人口的老齡化，世界糖尿病的發(fā)病率急劇升高。我國由于肥胖人群的增加，糖尿病的發(fā)病更是直線攀升，已經(jīng)超過印度成為全球糖尿病患者最多的國家。維生素D具有多種效應(yīng)，其在體內(nèi)的活性代謝物1,25-(OH)2D3與靶細(xì)胞上的維生素D受體 (vitamin D receptor,VDR)結(jié)合后，可發(fā)揮調(diào)節(jié)鈣磷代謝、抗炎癥、調(diào)控細(xì)胞有絲分裂、免疫調(diào)節(jié)和改善糖代

2、謝等生物學(xué)功能。國內(nèi)外的多項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查表明，維生素D可對(duì)糖尿病起到預(yù)防和治療的作用，但其作用機(jī)制尚不明確。
　　 目的：評(píng)價(jià)VDR基因敲除小鼠的生物學(xué)特性及其與糖尿病發(fā)生的關(guān)系；驗(yàn)證維生素D的活性代謝物1,25-(OH)2D3對(duì)1型糖尿病小鼠的防治作用，并探索1,25-(OH)2D3對(duì)1型糖尿病作用的分子機(jī)制，為糖尿病的防治和新藥靶位的發(fā)現(xiàn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：8～10周齡VDR基因敲除雜合子(VDR+/-

3、)小鼠雌雄合籠，PCR法鑒定子代小鼠基因型，記錄VDR基因敲除純合子(VDR-/-)、VDR+/-和野生型(VDR+/+)數(shù)量，統(tǒng)計(jì)小鼠繁殖性能，繪制生長曲線；比較子代同窩VDR-/-、VDR+/-和VDR+/+小鼠臟器的重量和組織學(xué)形態(tài)差異以及血液生理生化指標(biāo)的變化；將VDR-/-和VDR+/+小鼠分別尾靜脈注射四氧嘧啶，用藥后監(jiān)測血糖和尿糖一個(gè)月，統(tǒng)計(jì)糖尿病的發(fā)生率；為研究1,25-(OH)2D3對(duì)1型糖尿病的預(yù)防作用，健康小鼠以2

4、 μg/kg隔日腹腔注射1,25-(OH)2D3持續(xù)兩周后，用小劑量鏈脲佐菌素(STZ)連續(xù)多日注射法建立C57BL/6J小鼠1型糖尿病模型，比較1,25-(OH)2D3干預(yù)與否糖尿病的發(fā)病率；分別用1,25-(OH)2D3和雷帕霉素(RAPA)處理糖尿病小鼠，監(jiān)測小鼠血糖、體重、進(jìn)食量和飲水量，用病理切片和超薄切片觀察小鼠臟器的病理變化以及凋亡和自噬的發(fā)生，免疫組化法檢測VDR以及自噬和凋亡相關(guān)蛋白Beclin-1、Caspase-3

5、的表達(dá)量，流式細(xì)胞術(shù)測定脾臟Th1/Th2分群和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的數(shù)量；將具有胰島β細(xì)胞生理特性的小鼠胰島素瘤細(xì)胞株MIN6培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，研究1,25(OH)2D3對(duì)STZ所致細(xì)胞破壞的干預(yù)作用：ELISA法測定細(xì)胞胰島素的分泌量，MTT法測定細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率，Western Blot檢測Beclin-1和Bcl-2蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：⑴VDR+/-小鼠的平均妊娠期為22.5±1.78天，后代

6、中VDR-/-出現(xiàn)的幾率僅為5[％](8/165)；VDR-/-小鼠的體重和主要臟器的重量與同窩野生型和雜合子無明顯差異，但其肝臟、腎臟和脾臟有炎癥細(xì)胞浸潤、空泡變性等病變；VDR-/-小鼠的白細(xì)胞、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、甘油三酯、肌酸激酶、乳酸脫氫酶等明顯升高，鈣、磷含量明顯降低；四氧嘧啶作用后1周，VDR-/-小鼠的血糖均高于16.7 mmol/L，而野生型小鼠直到第3周只有50[％]的血糖高于閾值。⑵正常小鼠末次注射STZ后1周，血糖均≥1

7、6.7 mmol/L，預(yù)先注射1,25-(OH)2D3再用STZ處理的小鼠，其糖尿病的發(fā)病率顯著降低，末次注射STZ后2周，僅66.7[％]的小鼠血糖高于閾值。糖尿病組小鼠體重持續(xù)降低，飲食、飲水量以及隨機(jī)血糖持續(xù)增加，胰腺和腎臟有炎癥細(xì)胞浸潤，而用1,25-(OH)2D3治療14天后，小鼠的血糖降低，臟器VDR的表達(dá)量增加，病變減輕，其他生物學(xué)特性也有一定程度的改善。⑶電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察表明，糖尿病小鼠胰腺、腎臟、脾臟和胸腺均有明顯病

8、變，可見線粒體腫脹、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張和染色質(zhì)邊集等現(xiàn)象，用1,25-(OH)2D3治療后脾臟和胸腺凋亡的淋巴細(xì)胞增多，胰腺和腎臟的超微結(jié)構(gòu)好轉(zhuǎn)，且胰腺腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞內(nèi)可見到自噬泡；免疫組化顯示1,25-(OH)2D3處理后胰腺自噬蛋白Beclin-1的表達(dá)量升高，而凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)量降低；各組小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的分析表明1,25-(OH)2D3可降低小鼠脾臟中的Th1細(xì)胞，上調(diào)Th2和CD4+CD25+Treg細(xì)胞。糖

9、尿病小鼠被雷帕霉素作用后癥狀和臟器病變進(jìn)一步加重。MIN6細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明1,25-(OH)2D3預(yù)先干預(yù)，可促進(jìn)STZ作用的MIN6細(xì)胞胰島素的分泌，并降低其凋亡率，提高Beclin-1和Bcl-2蛋白的表達(dá)量。
　　 結(jié)論：①VDR基因敲除對(duì)后代的生長發(fā)育無明顯影響，但可引起炎癥、臟器功能和代謝的異常，使糖尿病發(fā)病率顯著升高，證實(shí)維生素D缺乏在糖尿病的發(fā)生中起重要的作用。②1,25-(OH)2D3預(yù)處理可降低模型動(dòng)物糖尿病的發(fā)生

10、率，對(duì)已發(fā)生的糖尿病有一定的治療作用，可作為糖尿病防治的備選配伍藥物。③1,25-(OH)2D3通過下述途徑影響1型糖尿病的進(jìn)程。首先，1,25-(OH)2D3可誘導(dǎo)胰腺細(xì)胞發(fā)生一定程度的自噬，通過清除凋亡因子或衰老的細(xì)胞器實(shí)現(xiàn)自我修復(fù)，從而增加胰島素的分泌量；其次，1,25-(OH)2D3可促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡，減少其對(duì)胰島的免疫攻擊；1,25-(OH)2D3還能降低Th1細(xì)胞、上調(diào)Th2和Treg細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫耐受；此外，1,25-(O