冷休克蛋白YB-1介導(dǎo)活化蛋白C對(duì)糖尿病心肌病的保護(hù)機(jī)制.pdf

1、研究背景及目的：
　　糖尿病是主要心血管危險(xiǎn)因素之一，嚴(yán)重危害著人類的身心健康。糖尿病明顯增加患者出現(xiàn)心力衰竭與心肌病的幾率。即使是在不合并高血壓與冠心病的情況下，糖尿病患者仍有風(fēng)險(xiǎn)出現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)與功能異常，這種直接因糖尿病所致的心肌病稱之為糖尿病心肌病。糖尿病心肌病的概念正逐漸得到廣泛的認(rèn)可，但糖尿病心肌病的致病機(jī)制及發(fā)生發(fā)展目前仍不完全清楚。
　　活化蛋白C(activated Protein C, aPC)一種具有抗凝以

2、及細(xì)胞保護(hù)作用的蛋白酶，可以通過抗凋亡、抗炎及調(diào)節(jié)能量代謝對(duì)心臟缺血再灌注損傷起保護(hù)作用，也對(duì)糖尿病腎病有很強(qiáng)的保護(hù)作用，但是aPC是否能對(duì)糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展起保護(hù)作用仍不明了。冷休克蛋白Y-box binding protein1(YB-1)是一種高度保守的核酸結(jié)合蛋白，受aPC調(diào)節(jié)，具有多種細(xì)胞效能，參與并調(diào)控了許多心臟疾病，但YB-1與aPC之間的內(nèi)在聯(lián)系以及在YB-1在糖尿病心肌病中扮演的角色目前并不清楚。本研究通過小鼠糖尿

3、病心肌病模型以及相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究YB-1、aPC與糖尿病心肌病之間的關(guān)系。
　　方法與結(jié)果
　　我們首先構(gòu)建小鼠糖尿病心肌病模型。選用C57BL/6雄性小鼠，在其8周齡時(shí)給予注射鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)，給藥方法為多次小劑量腹腔注射，60mg/kg，連續(xù)注射5天(STZ溶解于0.05M pH4.5的檸檬酸緩沖液)，對(duì)照組給予檸檬酸緩沖液腹腔注射。小鼠34周齡時(shí)終止實(shí)驗(yàn)。STZ注射一周后即出現(xiàn)血糖明

4、顯升高，以后穩(wěn)步升高至平臺(tái)期，提示實(shí)驗(yàn)早期階段可獲得穩(wěn)定的I型糖尿病模型。實(shí)驗(yàn)終止前運(yùn)用心臟超聲與導(dǎo)管檢查血流動(dòng)力學(xué)評(píng)估小鼠心臟功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病組小鼠心臟收縮、舒張功能明顯低于對(duì)照組。HE染色提示糖尿病組小鼠心肌細(xì)胞明顯腫脹，Western Blot結(jié)果提示糖尿病組小鼠心肌組織中ANP、BNP及β–MHC表達(dá)明顯升高。這些結(jié)果說明小鼠糖尿病心肌病模型構(gòu)建成功。
　　然后，我們檢測發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌病模型中aPC血漿含量以及心肌組織

5、中的YB-1蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。在細(xì)胞水平上，我們用高糖刺激H9C2心肌細(xì)胞系后ANP、BNP及β–MHC表達(dá)明顯升高，而aPC預(yù)處理組ANP、BNP及β–MHC表達(dá)水平較高糖處理組顯著下降。我們又進(jìn)一步使用質(zhì)粒及細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法把YB-1基因Knockdown，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YB-1基因的Knockdown明顯減弱了aPC的細(xì)胞保護(hù)作用。這些結(jié)果說明YB-1介導(dǎo)aPC在糖尿病心肌病中的保護(hù)作用。
　　接著，我們使用蛋白合成抑制劑

6、CHX抑制H9C2心肌細(xì)胞系的蛋白合成，發(fā)現(xiàn)aPC預(yù)處理組的YB-1蛋白降解速率明顯減慢，提示aPC具有維持YB-1蛋白穩(wěn)定性的作用。通過免疫共沉淀方法我們發(fā)現(xiàn)YB-1蛋白的減少與其泛素化有關(guān)，而aPC能減少YB-1蛋白的泛素化進(jìn)而維持YB-1的蛋白水平。最后我們使用相應(yīng)受體的阻滯劑與激動(dòng)劑，發(fā)現(xiàn)aPC通過PAR-1與EPCR受體受體調(diào)節(jié)YB-1的泛素化進(jìn)而調(diào)節(jié)YB-1的蛋白水平。
　　結(jié)論
　　綜合以上結(jié)果，我們數(shù)據(jù)證明Y