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文檔簡介
1、第一部分 mTOR介導(dǎo)胰島β細胞糖毒性凋亡以及1,25(OH)2VD3的保護作用研究
目的:證實糖毒性誘導(dǎo)胰島β細胞凋亡;探尋實驗性胰島β細胞糖毒性凋亡的最佳葡萄糖濃度;探討mTOR信號通路在胰島β細胞糖毒性凋亡中的作用;證實1,25(OH)2VD3對mTOR介導(dǎo)的胰島β細胞糖毒性凋亡的干預(yù)作用。
方法:本部分實驗分為兩個方面內(nèi)容:
?。?)培養(yǎng)胰島β細胞株(INS-1細胞),隨機分為:①正常葡萄糖濃度組(N
2、ormal glucose,NG):加入葡萄糖濃度為5.5mmol/L的培養(yǎng)液進行 INS-1細胞培養(yǎng);②高葡萄糖濃度組10(High glucose, HG10):加入葡萄糖濃度為10mmol/L的培養(yǎng)液進行INS-1細胞培養(yǎng);③高葡萄糖濃度組15(High glucose,HG15):加入葡萄糖濃度為15mmol/L的培養(yǎng)液進行INS-1細胞培養(yǎng);④高葡萄糖濃度組20(High glucose,HG20):加入葡萄糖濃度為20mmo
3、l/L的培養(yǎng)液進行 INS-1細胞培養(yǎng);⑤高葡萄糖濃度組25(High glucose,HG25):加入葡萄糖濃度為25mmol/L的培養(yǎng)液進行INS-1細胞培養(yǎng);⑥高葡萄糖濃度組30(High glucose,HG30):加入葡萄糖濃度為30mmol/L的培養(yǎng)液進行INS-1細胞培養(yǎng);⑦高葡萄糖濃度組35(High glucose,HG35):葡萄糖濃度為35mmol/L的培養(yǎng)液進行INS-1細胞培養(yǎng)。本實驗采用倒置顯微鏡觀察原位培養(yǎng)
4、細胞形態(tài)、臺盼藍拒染、MTT、流式細胞儀分析、電鏡等方法觀察不同濃度葡萄糖對體外培養(yǎng)的 INS-1細胞生長、增殖及凋亡作用的影響,觀察了不同濃度葡萄糖對胰島β細胞凋亡的現(xiàn)象。
(2)結(jié)合實驗內(nèi)容(1)結(jié)果中的高糖濃度,培養(yǎng)胰島β細胞株(INS-1細胞),分組如下:①正常葡萄糖濃度組(NG):葡萄糖濃度為5.5mmol/L培養(yǎng)液進行 INS-1細胞培養(yǎng);②正常葡萄糖濃度+1,25(OH)2VD3組(NG+VD3):葡萄糖濃度為5
5、.5mmol/L培養(yǎng)液加入1,25(OH)2VD3(10-6M)進行INS-1細胞培養(yǎng);③高葡萄糖濃度組(HG):分別加入葡萄糖濃度為25mmol/L培養(yǎng)液進行INS-1細胞培養(yǎng);④高葡萄糖濃度+1,25(OH)2VD3組(HG+ VD3):葡萄糖濃度為25mmol/L培養(yǎng)液加入1,25(OH)2VD3(10-6M)進行 INS-1細胞培養(yǎng);⑤高葡萄糖濃度+雷帕霉素組(HG+Rap):葡萄糖濃度為25mmol/L培養(yǎng)液加入雷帕霉素(20
6、nM)進行INS-1細胞培養(yǎng)。本實驗通過Western blotting檢測高糖誘導(dǎo)INS-1細胞凋亡過程中維生素D受體、DDIT4的表達,檢測mTOR信號通路上游蛋白TSC1/2、Rheb及下游蛋白p70S6K及其磷酸化表達、mTOR及其磷酸化表達情況,并以mTOR抑制劑雷帕霉素作為干預(yù)對照。
結(jié)果:①倒置顯微鏡下NG組INS-1細胞呈貼壁性生長,細胞形態(tài)規(guī)則,細胞密度增加。HG10組、HG15組INS-1細胞與NG組比較無
7、明顯變化,偶見發(fā)亮的細胞懸浮,隨時間延長,細胞密度稍有下降。HG20組、HG25組、HG30組、HG35組INS-1細胞與NG組比較細胞變小,發(fā)亮細胞懸浮,出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,細胞密度明顯下降。
②臺盼藍拒染及MTT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),NG組、HG10組在各時間點對INS-1細胞無明顯的增殖抑制作用,HG15組在第3天開始對INS-1細胞增殖有抑制作用,與 NG組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);HG20組、HG25組、HG30組和
8、HG35組對INS-1細胞增殖有抑制作用(P<0.05),隨時間延長,增殖抑制作用越明顯(P<0.01);IC50為HG25組。
?、垭婄R下可見HG15組、HG20組、HG25組、HG30組和HG35組INS-1細胞在36h后與NG組比較,出現(xiàn)凋亡細胞,可見較多凋亡小體。
④ AnnexinⅤ-FITC檢測HG20組、HG25組、HG30組及HG35組凋亡率分別為10.05%、15.1%、18.22%及22.43%,顯
9、著高于NG組凋亡率1.92%(P<0.01)。而 HG30組與 HG35組細胞死亡率分別為21.72%、29.65%,明顯高于NG組細胞死亡率2.30%(P<0.01)。
?、軳G組、NG+VD3組、HG組和HG+VD3組在24h、36h及48h時VDR蛋白表達均未見明顯差異(P>0.05)。
?、轍G組INS-1細胞在24h、36h及48h時DDIT4蛋白表達降低,與 NG組及 NG+VD3組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(
10、P<0.01),1,25(OH)2VD3干預(yù)后(HG+VD3組),在24h、36h及48h時INS-1細胞DDIT4蛋白表達與HG組比較,增高明顯(P<0.01),接近NG組及NG+VD3組表達水平(P>0.05)。
?、?HG組 INS-1細胞 TSC1、TSC2蛋白表達降低(P<0.05),1,25(OH)2VD3干預(yù)后(HG+VD3組),在24h、36h及48h時INS-1細胞TSC1、TSC2蛋白表達與HG組比較增高明顯
11、(P<0.01),接近NG組及NG+VD3組表達水平(P>0.05)。
?、郒G組INS-1細胞Rheb蛋白表達明顯增高,1,25(OH)2VD3干預(yù)后(HG+VD3組),在24h、36h及48h時INS-1細胞Rheb蛋白表達與HG組比較明顯降低(P<0.01),接近NG組及NG+VD3組表達水平(P>0.05)。
?、?HG組在24h、36h及48h時INS-1細胞mTOR蛋白及其磷酸化水平表達與NG組及NG+VD3
12、組比較均增高(P<0.01),mTOR蛋白磷酸化表達增高尤為明顯(P<0.01)。1,25(OH)2VD3干預(yù)后(HG+VD3組),在24h、36h及48h時INS-1細胞mTOR蛋白表達及其磷酸化水平與HG組比較明顯降低(P<0.01),接近NG組及NG+VD3組表達水平(P>0.05)。
?、釮G組在24h、36h及48h時INS-1細胞p70S6K蛋白及其磷酸化水平表達與NG組及NG+VD3組比較均增高(P<0.01),p
13、70S6K蛋白磷酸化表達增高尤為明顯(P<0.01)。1,25(OH)2VD3干預(yù)后(HG+VD3組),在24h、36h及48h時INS-1細胞p70S6K蛋白表達及其磷酸化水平與HG組比較明顯降低(P<0.01),接近NG組及NG+VD3組表達水平(P>0.05)。
結(jié)論:葡萄糖濃度大于10mmol/L可以誘導(dǎo)胰島β細胞凋亡,IC50為25mmol/L,葡萄糖濃度達到25mmol/L時,胰島β細胞凋亡明顯,而細胞死亡并不顯著
14、,葡萄糖誘導(dǎo)胰島β細胞凋亡呈時間-濃度依賴性;高糖及高糖聯(lián)合1,25(OH)2VD3干預(yù)對INS-1細胞VDR蛋白表達影響較之正常組無顯著差異。高糖降低 INS-1細胞中 DDIT4表達,而1,25(OH)2VD3可以逆轉(zhuǎn)這一作用。高糖降低INS-1細胞中TSC1、TSC2表達,以TSC2表達降低為主,高糖增高INS-1細胞中Rheb、mTOR及其磷酸化、p70S6K及其磷酸化表達,而1,25(OH)2VD3可以逆轉(zhuǎn)這一作用。高糖異常激
15、活mTOR信號通路,而1,25(OH)2VD3通過與VDR結(jié)合,增加DDIT4表達,從而增加TSC1/2表達,降低Rheb、mTOR及其磷酸化、p70S6K及其磷酸化表達,干預(yù)胰島β細胞糖毒性凋亡。
第二部分1,25(OH)2VD3干預(yù)mTOR介導(dǎo)的胰島β細胞糖毒性凋亡途徑研究
目的:研究1,25(OH)2VD3及mTOR抑制劑雷帕霉素干預(yù)胰島β細胞糖毒性凋亡作用;探討1,25(OH)2VD3干預(yù)mTOR信號通路介導(dǎo)
16、的胰島β細胞糖毒性凋亡途徑。
方法:體外培養(yǎng)胰島β細胞INS-1,隨機化分為:①正常葡萄糖濃度組(NG):葡萄糖濃度為5.5mmol/L培養(yǎng)液進行INS-1細胞培養(yǎng);②正常葡萄糖濃度+1,25(OH)2VD3組( NG+VD3):葡萄糖濃度為5.5mmol/L培養(yǎng)液加入1,25(OH)2VD3(10-6M)進行INS-1細胞培養(yǎng);③高葡萄糖濃度組(HG):分別加入葡萄糖濃度為25mmol/L培養(yǎng)液進行INS-1細胞培養(yǎng);④高葡
17、萄糖濃度+1,25(OH)2VD3組(HG+VD3):葡萄糖濃度為25mmol/L培養(yǎng)液加入1,25(OH)2VD3(10-6M)進行INS-1細胞培養(yǎng);⑤高葡萄糖濃度+雷帕霉素組(HG+Rap):葡萄糖濃度為25mmol/L培養(yǎng)液加入雷帕霉素(20nM)進行INS-1細胞培養(yǎng)。
應(yīng)用倒置顯微鏡觀察、臺盼藍拒染、MTT、流式細胞儀分析和電鏡等方法觀察1,25(OH)2VD3干預(yù)體外培養(yǎng)的INS-1細胞糖毒性凋亡的作用,并以mT
18、OR抑制劑雷帕霉素作為干預(yù)對照,通過Western blotting檢測凋亡途徑Bcl-2相關(guān)級聯(lián)蛋白表達。
結(jié)果:①倒置顯微鏡下HG組INS-1細胞在24h、36h和48h與NG組比較細胞密度明顯下降,漂浮的發(fā)亮細胞較多。HG+VD3組、HG+Rap組與NG組和NG+VD3組INS-1細胞形態(tài)類似,呈貼壁性生長,不規(guī)則形,大小均一,細胞密度增加。
?、谂_盼藍拒染結(jié)果及MTT實驗均發(fā)現(xiàn),HG組抑制INS-1細胞增殖,與
19、NG組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),隨時間延長,增殖抑制作用越明顯(P<0.01),1,25(OH)2VD3和雷帕霉素干預(yù)后發(fā)現(xiàn)細胞增殖得到恢復(fù),與 NG組及 NG+VD3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
?、垭婄R下HG組與NG組及NG+VD3組比較,細胞體積縮小,核仁減少或消失,出現(xiàn)較多凋亡小體。1,25(OH)2VD3和雷帕霉素干預(yù)后發(fā)現(xiàn)凋亡細胞明顯減少(P<0.05)。
④AnnexinⅤ-FI
20、TC檢測發(fā)現(xiàn)HG組與NG組比較凋亡率增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),隨時間延長,凋亡率增高越明顯;而HG+VD3組和HG+Rap組凋亡率與HG組比較明顯降低(P<0.05),與NG組及NG+VD3組比較無明顯改變(P>0.05)。
?、?HG組在24h和36h時Bcl-2蛋白表達均較NG組和NG+VD3組降低(P<0.01),在48h時Bcl-2蛋白表達與NG組及NG+VD3組比較無明顯差異(P>0.05),但Bcl-
21、2磷酸化蛋白表達在24h、36h及48h與NG組及NG+VD3組比較明顯增高(P<0.01)。HG+VD3組和HG+Rap組在上述三個時間點Bcl-2蛋白及其磷酸化蛋白表達與NG組及NG+VD3組比較均無明顯差異(P>0.05)。
⑥HG組在24h和36h時Cleaved-Caspase3蛋白表達均較NG組和NG+VD3組明顯增加(P<0.01),在48h時Cleaved-Caspase3蛋白表達與NG組及NG+VD3組比較無
22、明顯差異(P>0.05)。HG+VD3組和HG+Rap組在上述三個時間點Cleaved-Caspase3蛋白表達與NG組及NG+VD3組比較均無明顯差異(P>0.05)。
?、逪G組在24h、36h和48h時細胞色素C蛋白表達均較NG組和NG+VD3組明顯增加(P<0.01),在36h時增加最為明顯。HG+VD3組和 HG+Rap組在上述三個時間點細胞色素 C蛋白表達與 NG組及NG+VD3組比較均無明顯差異(P>0.05)。<
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