腦內(nèi)嗅鞘細(xì)胞移植對(duì)mSOD1G93A ALS大鼠治療作用的研究.pdf

1、目的：觀察熒光大鼠嗅球來(lái)源的嗅鞘細(xì)胞經(jīng)顱移植到放射冠后對(duì)mSOD1G93A轉(zhuǎn)基因ALS大鼠的發(fā)病時(shí)間、生存率、行為學(xué)等方面的影響，探討嗅鞘細(xì)胞經(jīng)顱移植到放射冠對(duì)mSOD1G93A轉(zhuǎn)基因ALS大鼠的治療作用及相關(guān)機(jī)制，為臨床ALS治療提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)學(xué)證據(jù)。
　　 方法：⑴出生21天的仔鼠剪鼠尾適量，DNA提取后PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。⑵新生1周的SD大鼠，熒光顯微鏡下觀察，篩選出熒光表現(xiàn)陽(yáng)性的大

2、鼠備用，先用碘伏消毒其全身，尤其是頭頸部，再用酒精噴灑脫碘后拿到超凈工作臺(tái)內(nèi)，用消毒剪沿頸部剪下，換剪刀后沿頭頂正中線剪開(kāi)皮膚和顱骨，取出雙側(cè)嗅球，放于冰塊上的DF-12內(nèi)，清洗三遍，解剖鏡下剝膜，頭部難剝離部分可適當(dāng)保留，用眼科剪剪成1立方毫米大小的組織塊，將剪碎的組織塊移入15ml離心管，用彎頭吸管來(lái)回輕輕吹打，制成細(xì)胞懸液，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，以13％的血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液平均鋪入經(jīng)多聚賴氨酸包板后的細(xì)胞培養(yǎng)板中，在CO2培

3、養(yǎng)箱中培養(yǎng)。⑶包括形態(tài)學(xué)鑒定和免疫熒光染色鑒定，形態(tài)學(xué)鑒定可在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，類似小蝌蚪樣，胞體呈球形或星形，周圍有突起。Hoechst標(biāo)記細(xì)胞核，同時(shí)用P75NGFR和S-100染色進(jìn)行免疫熒光鑒定，激光共聚焦顯微鏡下觀察，染色雙陽(yáng)性細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)量相比即得到嗅鞘細(xì)胞的純度。⑷嗅鞘細(xì)胞移植所用儀器是立體定位儀，對(duì)象是90日齡野生型大鼠和mSOD1G93A轉(zhuǎn)基因大鼠。大鼠4％水合氯醛麻醉后，俯臥于手術(shù)臺(tái)上，用立體定位儀固定，

4、去掉大鼠頭部的毛發(fā)，在顱骨距離前囟2毫米，中線右側(cè)1.5毫米的位置開(kāi)一個(gè)直徑大約5毫米的孔，玻璃微注射器插入到放射冠(距離表面2.75毫米)。將5微升的細(xì)胞懸液(約個(gè)5×105嗅鞘細(xì)胞)或者是DF12在十分鐘之內(nèi)緩慢的注射到孔內(nèi)。手術(shù)過(guò)程中不使用環(huán)胞霉素，而在術(shù)后所有動(dòng)物連續(xù)三天按每天每千克體重10毫克的量皮下注射青霉素預(yù)防感染。⑸所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自出生后90天起進(jìn)行發(fā)病時(shí)間、生存時(shí)間、體重及相應(yīng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的觀察。⑹所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于細(xì)胞移

5、植后5周(125天)及7周(139天)取大腦皮層和腰段脊髓進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)。細(xì)胞移植后五周取材的脊髓做冠狀切片的尼氏染色，計(jì)算各組的神經(jīng)元數(shù)量。顯微鏡下觀察運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，記錄細(xì)胞形態(tài)完整的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量。⑺細(xì)胞移植后五周和七周取材的冰凍切片做ChAT蛋白的免疫組織化學(xué)染色。冰凍切片機(jī)切片后將片子放到37度烤箱內(nèi)烤30分鐘，進(jìn)行防脫片處理，放到搖床上用PBS洗三遍，血清孵育2h后加入一抗過(guò)夜，復(fù)溫后再洗三遍，加入二抗室溫孵育1小時(shí)，Hoe

6、chst進(jìn)行細(xì)胞核染色，封片保存待觀察。⑻處死大鼠后快速取所需要的組織并提取蛋白，測(cè)定濃度后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將電泳產(chǎn)物進(jìn)行硝酸纖維素轉(zhuǎn)膜，產(chǎn)物進(jìn)行封閉雜交，暗室內(nèi)曝光，凝膠圖像分析儀掃描得到的圖像，Quantity One軟件分析條帶光密度。
　　 結(jié)果：①嗅鞘細(xì)胞移植到SOD1G93A轉(zhuǎn)基因大鼠放射冠兩周后，熒光顯微鏡下觀察表達(dá)綠熒光蛋白的嗅鞘細(xì)胞在移植大鼠的放射冠移植點(diǎn)周圍彌散分布。移植后5周，彌散到更遠(yuǎn)的地方，移植后7

7、周，逐漸消失，但仍有少量存活。②各組大鼠的四肢出現(xiàn)異常的平均時(shí)間均為125天左右，即各組發(fā)病時(shí)間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而嗅鞘細(xì)胞移植組的生存時(shí)間和疾病過(guò)程中的各項(xiàng)指標(biāo)均明顯好于其他幾組，即細(xì)胞移植延長(zhǎng)了大鼠的生存時(shí)間，改善了發(fā)病到死亡過(guò)程中大鼠的各項(xiàng)生理指標(biāo)。③大腦皮層和腰段脊髓的前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元尼氏染色顯示，SOD1G93A轉(zhuǎn)基因大鼠發(fā)病后出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的大量死亡，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.001)。OEC移植組SOD1G93A轉(zhuǎn)基因大鼠的運(yùn)動(dòng)

8、神經(jīng)死亡的數(shù)量遠(yuǎn)少于其他兩組。ChAT的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與尼氏染色結(jié)果一致。④野生的陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的ChAT蛋白水平遠(yuǎn)高于嗅鞘細(xì)胞移植組，但細(xì)胞移植組又高于未經(jīng)治療的其他兩組，并均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而培養(yǎng)基注射組和SOD1G93A組的ChAT蛋白水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01)。
　　 結(jié)論：嗅鞘細(xì)胞移植可以延緩SOD1G93A轉(zhuǎn)基因大鼠的發(fā)病時(shí)間，改善發(fā)病后大鼠的運(yùn)動(dòng)功能，并使其生存時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，移植后的嗅鞘細(xì)胞可以在大鼠體內(nèi)