人骨髓間質干細胞與胚胎嗅鞘細胞聯(lián)合移植治療大鼠脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、研究背景： 脊髓損傷是常見創(chuàng)傷，已經(jīng)成為青壯年殘疾、喪生勞動力的重要原因之一。脊髓損傷目前治療的主要手段有藥物治療，手術治療及康復訓練。藥物治療主要針對減輕既發(fā)性損傷，目前有效藥物種類少(目前臨床常用并獲得較廣泛共識的僅為糖皮質激素類和神經(jīng)節(jié)苷脂)，強調藥物應用的時效性，如損傷后8小時內大劑量甲基強的松龍是唯一經(jīng)美國食品及藥物管理局(FDA)批準并通過Ⅲ期臨床試驗的藥物。復位，減壓，固定以維持脊柱的穩(wěn)定，避免不適當?shù)陌徇\方法及治

2、療手段造成脊髓的二次損傷及持續(xù)損傷是手術治療首要解決的問題。手術治療的另一方面是通過移植具有治療作用的種子細胞，促進脊髓損傷的功能恢復?？祻椭委煹哪康氖峭诰蚱渥陨頋摿Γ畲笙薅鹊匕l(fā)揮殘存功能，提高患者的生存質量。 脊髓損傷后造成損傷平面以下的肢體癱瘓是目前治療上面臨的最重要問題。目前認為移植具有治療作用的種子細胞是這方面最有可能取得突破的方法。骨髓間質干細胞(marrowmesenchymalstemcells，MSCs)與嗅鞘

3、細胞(olfactoryensheathingcells，OECs)是近年來倍受人們關注的候選種子細胞。骨髓間質干細胞從骨髓中分離，來源豐富，在體外培養(yǎng)能保持其多向分化潛能，可在脊髓損傷處長期存活并可向神經(jīng)細胞方向分化替代喪失神經(jīng)元參與重建神經(jīng)傳導通路，但僅在脊髓損傷微環(huán)境誘導下分化為神經(jīng)元的數(shù)量很少，限制了其更好的發(fā)揮修復功能；經(jīng)體外定向誘導為神經(jīng)元樣細胞后，細胞凋亡、死亡大量增加，植入體內后存活細胞很少。嗅鞘細胞是存在于嗅球的最外兩

4、層以及嗅黏膜上皮中的一種特殊的大膠質細胞，在嗅神經(jīng)終生再生或修復中發(fā)揮重要功能，在一定程度上可促進脊髓損傷神經(jīng)再生及軸突的髓鞘化。新的觀點認為嗅鞘細胞在嗅覺系統(tǒng)中，不僅可通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子促進嗅神經(jīng)元的存活及再生，而且可與嗅覺系統(tǒng)的干細胞相互作用，促進干細胞向嗅神經(jīng)方向分化，促進嗅神經(jīng)的成熟。最近王葵光等發(fā)現(xiàn)嗅鞘細胞可以促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化，沈慧勇等認為嗅鞘細胞可以啟動與之共培養(yǎng)的骨髓間質干細胞向神經(jīng)元分化的程序。因此本實驗研

5、究聯(lián)合移植人骨髓間質干細胞與胚胎嗅鞘細胞對脊髓損傷修復的治療效果。 目的： 觀察人骨髓間質干細胞與胚胎嗅鞘細胞聯(lián)合移植治療脊髓損傷的治療效果，探討共移植的嗅鞘細胞對脊髓骨髓間質干細胞源性細胞分化的影響。 方法： 從成人骨髓分離培養(yǎng)人骨髓間質干細胞，從流產(chǎn)胚胎嗅球分離培養(yǎng)人胚胎嗅鞘細胞。60只SD大鼠采用ALLEN法制作脊髓急性損傷模型，隨機分為四組：骨髓間質干細胞移植組，嗅鞘細胞移植組，聯(lián)合移植組，PBS

6、移植對照組，在損傷局部移植相應細胞。采用BBB后肢功能評分比較大鼠后肢功能恢復情況；運動誘發(fā)電位潛伏期評估脊髓傳導性能改善情況；細胞移植5周后，采用組織學方法分析脊髓病理改變、軸突再生、植入嗅鞘細胞和骨髓間質干細胞的存活與分化情況。 結果： 1.骨髓間質干細胞來源豐富，可從骨髓中分離，一般培養(yǎng)條件下易大量擴增，傳代培養(yǎng)生物學特性穩(wěn)定，保持多分化潛能；嗅鞘細胞取材于經(jīng)水囊引產(chǎn)的胚胎嗅球，而藥物引產(chǎn)的胚胎分離培養(yǎng)不易成功，故

7、嗅鞘細胞來源明顯受限，且一般培養(yǎng)條件不易大量擴增，細胞易老化。兩者均不表達與移植免疫排斥發(fā)生密切相關的細胞表面抗原。 2.BBB后肢功能評分從第1周起所有治療組均比對照組高；第2周起聯(lián)合移植組比其他組高，骨髓間質干細胞組比嗅鞘細胞組高。 3.顱磁刺激運動誘發(fā)電位檢測，在第1周末，僅3只鼠引出誘發(fā)電位，第2周所有大鼠均恢復，潛伏期明顯延長。第2周-4周，潛伏期隨時間有所回復，各組動物潛伏期比前一星期回復明顯，第4周-5周各

8、組潛伏期不再隨時間而明顯回落，基本維持穩(wěn)定；第2周-5周，聯(lián)合移植組比其他組潛伏期回復明顯，骨髓間質干細胞組與嗅鞘細胞組均比對照組恢復明顯，但兩組間差別沒有顯著性。 4.組織病理改變分析。1-2周HE染色可觀察到脊髓損傷處灰質內大面積出血；神經(jīng)元萎縮，胞質收縮；白質軸索變性，壞死，成空泡樣改變；大量小膠質細胞結節(jié)樣增生，大量炎性細胞浸潤等改變。細胞移植后5周HE染色可觀察到脊髓結構破壞，損傷中央及毗鄰區(qū)大量神經(jīng)元萎縮，消失；偶可

9、見膠質細胞結節(jié)樣增生；灰白質分界模糊，可見囊性軟化灶，軸索變性，空泡樣改變等。各組大鼠均可存在上述改變，個體差異較大，程度略有不同，各組病理改變沒有明顯的區(qū)別。 5.再生軸突的觀察。甘氨酸銀浸鍍法染色，對照組脊髓損傷區(qū)近端可觀察到再生神經(jīng)軸突極少，損傷區(qū)幾乎不見軸突。骨髓間質干細胞組及嗅鞘細胞組脊髓損傷區(qū)近端可觀察到較多再生神經(jīng)軸突，并向損傷區(qū)伸展，距離較長，部分抵達損傷處，損傷區(qū)可觀察到神經(jīng)軸突稀疏分布。聯(lián)合移植組脊髓損傷區(qū)近

10、端可觀察到大量再生神經(jīng)軸突，成束向損傷邊緣延伸，在損傷區(qū)可觀察到較多神經(jīng)軸突，分布較密。各組均未發(fā)現(xiàn)再生神經(jīng)軸突成束穿越損傷區(qū)的直接證據(jù)。 6.植入細胞的追蹤。聯(lián)合移植組及嗅鞘細胞組切片上可觀察到Hoechst標記的移植細胞，主要分布于損傷區(qū)后索區(qū)域：聯(lián)合移植組及骨髓間質干細胞組切片可觀察到Brdu標記細胞主要分布于損傷區(qū)后索區(qū)域及后角部分區(qū)域。聯(lián)合移植組脊髓MSCs源性細胞表達Nestin，NF的細胞百分比均比MSCs移植組高

11、，MSCs源性細胞表達GFAP的細胞百分比兩組間沒有明顯差別。 結論： 1.骨髓間質干細胞與胚胎嗅鞘細胞移植治療脊髓損傷的機理有所不同，治療效果相近，前者在移植細胞來源及制備上具有明顯優(yōu)勢。 2.骨髓間質干細胞與胚胎嗅鞘細胞聯(lián)合移植時，共移植胚胎嗅鞘細胞可促進脊髓骨髓間質干細胞源性細胞向神經(jīng)元轉化，提高骨髓間質干細胞源性細胞分化為神經(jīng)元的比例；共移植骨髓間質干細胞與胚胎嗅鞘細胞在脊髓損傷修復中可以發(fā)揮協(xié)同作用，與