神經(jīng)干細(xì)胞和嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞共培養(yǎng)及移植治療切割海馬傘大鼠的研究.pdf

1、目的：
　　 比較大鼠嗅粘膜（OlfactoryMucosa，OM）和嗅球（OlfactoryBulb，OB）嗅鞘細(xì)胞(Olfactoryensheathingcells，OECs)在體外分離培養(yǎng)中增殖和分化以及生物學(xué)特性的差異；研究嗅粘膜OECs和神經(jīng)干細(xì)胞(Neuralstemcells，NSCs)直接接觸和非直接接觸共培養(yǎng)對(duì)NSCs增殖和分純的影響；將嗅粘膜OECs和NSCs移植到切割海馬傘大鼠腦中，觀察大鼠行為改善以及N

2、SCs的存活和分化情況。為應(yīng)用嗅鞘細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 (1)分別取SD大鼠嗅粘膜(OM)和嗅球(OB)用差速貼壁法在體外分離培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞(OECs)，在倒置顯微鏡下觀察并拍攝嗅鞘細(xì)胞的生長(zhǎng)情況；
　　 (2)用掃描電鏡觀察嗅粘膜及唉球OECs的形態(tài)；
　　 (3)用Elisa法檢測(cè)嗅粘膜及嗅球OECs培養(yǎng)液上清中NGF和BDNF的含量；
　　 (4)

3、用p75NGFR和S-100免疫熒光抗體雙標(biāo)記檢測(cè)嗅粘膜及嗅球OECs體外增殖和分化情況。
　　 (5)用體外分離培養(yǎng)獲得的嗅粘膜OECs和NSCs，直接接觸組用24孔培養(yǎng)板、非直接接觸組用高通量24孔Transwell培養(yǎng)板共培養(yǎng)OECs和NSCs，單純NSCs組作為對(duì)照組，比較各組NSCs分化為神經(jīng)元的情況。
　　 (6)用體外分離培養(yǎng)的大鼠嗅粘膜OECs和NSCs，將單純NSCs、Transwell組下層的NSCs

4、、直接接觸組OECs和NSCs移植到切割雙側(cè)海馬傘的SD大鼠雙側(cè)海馬齒狀回中，對(duì)照組注射生理鹽水。移植后2W、4W、6W和8W行避暗回避試驗(yàn)和跳臺(tái)試驗(yàn)。然后灌注、取腦和冰凍切片，用BrdU和MAP-2免疫熒光抗體雙標(biāo)記檢測(cè)移植的NSCs存活和分化情況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)嗅粘膜OECs與嗅球OECs在原代培養(yǎng)各時(shí)期OECs球的形成、數(shù)量和大小無明顯差異：
　　 (2)掃描電鏡顯示：嗅粘膜OECs以雙極樣細(xì)

5、胞為主；嗅球OECs的形態(tài)有3種：雙極樣細(xì)胞、三極樣細(xì)胞和扁圓形細(xì)胞，其中以對(duì)稱突起的雙極樣細(xì)胞為主。
　　 (3)ELISA測(cè)定結(jié)果顯示：兩種OECs上清液中均含有NGF和BDNF，含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高；褥培養(yǎng)各相同時(shí)期的嗅粘膜OECs分泌的NGF和BDNF濃度與嗅球OECs相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (4)p75NGFR和S-100免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示：嗅粘膜(OM)和嗅球(OB)組S-100和p75NGF

6、R雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)量均較多，嗅粘膜嗅鞘細(xì)胞以雙極樣細(xì)胞為主，其胞體多為細(xì)長(zhǎng)的梭形，突起細(xì)長(zhǎng)。嗅球嗅鞘細(xì)胞的形態(tài)多樣，有雙極樣細(xì)胞、三極樣細(xì)胞和扁圓形細(xì)胞，胞體呈長(zhǎng)梭形、三角形或圓形。兩組OECs的純化率、胞體面積和細(xì)胞周長(zhǎng)這三項(xiàng)指標(biāo)均沒有顯著性差異。
　　 (5)直接接觸組和Transwell組MAP-2陽性細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量多，較大，突起長(zhǎng)而且分枝豐富；直接接觸組陽性細(xì)胞胞體胞體要明顯大于其他兩組。直接接觸組和Transwell組的M

7、AP-2陽性細(xì)胞比例、細(xì)胞周長(zhǎng)均大于對(duì)照組，而直接接觸組和Transwell組相比，直接接觸組的MAP-陽性細(xì)胞周長(zhǎng)大于Transwell組，但兩組MAP-2陽性細(xì)胞比例無明顯差異。
　　 (6)細(xì)胞移植術(shù)后行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果：直接接觸組和其他3組大鼠避暗回避試驗(yàn)探索次數(shù)和滯留時(shí)間相比差異有顯著性。移植后6W和8W直接接觸組和NSCs組、Transwell組避暗回避試驗(yàn)探索次數(shù)比較差異有顯著性。3組細(xì)胞移植組和對(duì)照組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的主

8、動(dòng)及總回避陽性率比較差異有顯著性，直接接觸組細(xì)胞移植術(shù)后大鼠的跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)主動(dòng)回避率明顯高于NSCs組和Transwell組。兩兩比較結(jié)果：直接接觸組分別和NSCs組、Transwell組比較差異有顯著性。三組移植細(xì)胞進(jìn)行MAP-2和BrdU免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示：三組移植區(qū)腦組織切片中均有MAP-2和BrdU雙標(biāo)陽性細(xì)胞，直接接觸組和Transwell組中的雙標(biāo)陽性細(xì)胞明顯多于單純NSCs組，直接接觸組雙標(biāo)陽性細(xì)胞的胞體明顯大于fransw

9、ell組和NSCs組。
　　 結(jié)論：
　　 (1)嗅粘膜OECs與嗅球OECs一樣能在體外分離培養(yǎng)和增殖。嗅粘膜OECs以雙極樣細(xì)胞為主，而嗅球OECs的形態(tài)多樣，有雙極樣細(xì)胞、三極樣細(xì)胞和扁圓形細(xì)胞。嗅粘膜OECs與嗅球OECs均能分泌NGF和BDNF。嗅粘膜OECs與嗅球OECs分化成熟后的形態(tài)無明顯差異。
　　 (2)OECs與NSCs直接接觸和非直接接觸共培養(yǎng)均能明顯提高NSCs向神經(jīng)元分化的比例。OEC