黃芩苷對實驗性肺纖維化大鼠肺內MMP-13和TIMPS失衡的影響.pdf

1、目的：肺纖維化（pulmonaryfibrosis，PF）是以肺泡間質炎癥細胞浸潤、纖維細胞增生和細胞外基質進行性沉積為主要特征的慢性間質性肺疾病。其發(fā)病機制還不十分清楚，目前尚無理想的治療方法?；|金屬蛋白酶組織抑制因子(tissueinhibitorofmetal-oproteinases，TIMPs)作為MMP-13的組織特異性拮抗劑，在肺纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展過程中有其獨特的作用。以往研究表明，MMP-13與TIMPs之間的失衡是

2、導致肺纖維化的重要機制之一。
　　 本實驗觀察Ba對BLM模型大鼠肺纖維化形成早期及晚期階段肺內MMP-13含量和活性及TIMPs活性的影響，以闡明黃芩苷防治肺纖維化的機制，為此藥的臨床應用提供實驗資料。
　　 方法：明膠酶譜法檢測MMP-13含量和活性；反義酶譜法檢測TIMPs的活性；用天狼猩紅組化染色和肺組織羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量測定，判斷大鼠肺纖維化程度；HE染色觀察大鼠肺組織的形態(tài)學

3、改變，并為天狼猩紅組化染色膠原含量測定提供部位依據。
　　 將60只健康清潔級大鼠隨機分為三組：1.動態(tài)觀察組(n=12:分7d，14d和28d3個時間點。大鼠分別于氣管內一次性滴注BLM(5mg/kg)或NS（0.5ml/kg）后第8d，15和29d被處死取肺，用于檢測MMP-13含量和活性及TIMPs的活性。2.早期給藥組（即1-14d給藥組）(n=16)：其中14dNS+14dNS大鼠(n=3)于氣管內一次性滴注NS(0.

4、5ml/kg)后，每天腹腔注射NS(1ml/kg)，連續(xù)14天；14dM+14dNS大鼠(n=8)于氣管內滴注BLM(5mg/kg)后，每天腹腔注射NS(1ml/kg)，連續(xù)14天；14dM+14dBa大鼠(n=5)氣管內滴注BLM(5mg/kg)后，每天腹腔注射Ba(12.5mg/kg)，連續(xù)14天。此組大鼠于氣管給藥后第15d取肺，肺組織分別用于檢測MMP-13含量和活性及TIMPs活性、形態(tài)學觀察（天狼猩紅和HE染色）。3.晚期給

5、藥組（即14-28d給藥）(n=32)：其中28dNS+后14dNS大鼠(n=9)在氣管內一次性滴注NS(0.5ml/kg)后第14d至28d期間，每天腹腔注射NS(1ml/kg)；28dM+后14dNS大鼠(n=10)在氣管內一次性滴注BLM(5mg/kg)后第14d至28d期間，每天腹腔注射NS(1ml/kg)；28dM+后14dBa大鼠(n=13)于氣管內一次性滴注BLM(5mg/kg)后第14d至28d期間，每天腹腔注射Ba(1

6、2.5mg/kg)。大鼠均在氣管滴注后第29d取肺，分別用于檢測MMP-13含量和活性及TIMPs活性、形態(tài)學觀察（天狼猩紅染色和HE染色）以及羥脯氨酸含量的測定。
　　 JEDA-801D形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)計算肺組織膠原天狼猩紅染色的陽性面積百分比；Alpha分析軟件分析MMP-13的含量和活性及TIMPs的活性。采用SPSS-13.0統(tǒng)計軟件，MMP-13的含量和活性及TIMPs的活性的數據通過秩轉換結合完全隨機設計方差分析

7、來進行組間差異的兩兩比較以P＜0.05作為判斷差異顯著性的標準。HYP和膠原含量的所有數據用均數±標準差(x±SD)表示，采用SPSS-13.0統(tǒng)計軟件，多個樣本均數比較用單因素方差分析(One-WayANOVA)，多個樣本均數間的兩兩比較用最小顯著差法（leastsignificantdifference，LSD），以P＜0.05作為判斷差異顯著性的標準。
　　 結果：1.一般情況觀察在觀察期間，14dNS+14dNS大鼠和2

8、8dNS+后14dNS大鼠均表現(xiàn)活潑，反應靈敏，皮毛光滑。14dM+14dNS大鼠和28dM+后14dNS大鼠活動遲緩，毛發(fā)晦暗豎立，并伴有喘息，食欲差，體重低。14dM+14dBa大鼠和28dM+后14dBa大鼠均食欲，毛色，體重及活動情況較BLM大鼠有所好轉。
　　 2.肺纖維化形成中肺MMP-13和TIMPs活性的變化。
　　 2.1MMP-13活性的動態(tài)變化：BLM大鼠肺MMP-13的活性在氣管滴注BLM后第7d

9、即有升高，14d達高峰，此后開始下降。
　　 2.2TIMPs活性的動態(tài)變化：與NS大鼠相比，BLM大鼠肺TIMP-1的活性在氣管滴注BLM后第7d增強，14d減弱，28d仍減弱。而TIMP-2和TIMP-3的活性第7d減弱，14d增強，28d又開始減弱。
　　 3.Ba對肺纖維化形成早期肺MMP-13含量和活性及TIMPs活性的影響3.1早期肺MMP-13含量和活性的變化：與14dNS+14dNS大鼠相比，14dM+1

10、4dNS大鼠肺MMP-13含量升高（P＜0.01）、活性增強(P＜0.01)。與14dM+14dNS大鼠相比，14dM+14dBa大鼠MMP-13雖含量有所升高、活性有所增強，但其差異尚無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。
　　 3.2早期肺TIMPs活性的變化：與14dNS+14dNS大鼠相比，14dM+14dNS大鼠肺TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3活性差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。與14dM+14dNS大鼠相比

11、，14dM+14dBa大鼠TIMP-1TIMP-2和TIMP-3活性差異均無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)。
　　 4.Ba對肺纖維化形成晚期肺MMP-13含量和活性及TIMPs活性的影響4.1晚期肺MMP-13含量和活性的變化：與28dNS+后14dNS大鼠相比，28dM+14dNS大鼠肺MMP-13含量明顯降低(P＜0.05)，而活性的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dBa大

12、鼠MMP-13含量升高(P＜0.001)、活性增強(P＜0.01)，并與28dNS+后14dNS大鼠的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。
　　 4.2晚期肺TIMPs活性的變化：與28dNS+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dNS大鼠肺TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3活性差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。與28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dBa大鼠TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3活性

13、差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。5.Ba對肺纖維化形成早期肺組織形態(tài)學和肺間質膠原的影響5.1HE染色后肺組織形態(tài)學觀察結果：14dNS+14dNS大鼠肺結構正常，無炎癥表現(xiàn)；14dM+14dNS大鼠肺泡間隔明顯增寬，成纖維細胞和膠原基質明顯增多，局部有肺實變。與14dM+14dNS大鼠相比，14dM+14dBa大鼠肺組織形態(tài)學沒有明顯減輕。
　　 5.2天狼猩紅組化法檢測結果：14dNS+14dNS大鼠、14dM+14d

14、NS大鼠肺間質膠原面積百分比分別為(0.47±0.06)和(1.04±0.06)。與14dNS+14dNS大鼠比較，14dM+14dNS大鼠肺間質膠原面積明顯增大(P＜0.001)，且與14dM+14dNS大鼠比，14dM+14dBa肺間質膠原面積百分比(0.99±0.03)的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 6.Ba對肺纖維化形成晚期肺組織形態(tài)學及肺間質膠原的影響6.1HE染色后肺組織形態(tài)學結果：28dNS+后14dN

15、S大鼠肺結構正常，無炎癥表現(xiàn)；28dM+后14dNS大鼠肺間質細胞數目明顯增多，肺泡壁增厚，肺泡腔塌陷，肺泡融合，肺泡結構消失，局部有肺實變，間質纖維化瘢痕形成。與28dM+后14dNS大鼠比較，28dM+后14dBa大鼠肺組織形態(tài)學改變明顯減輕。
　　 6.2天狼猩紅組化法檢測結果：28dNS+后14dNS大鼠、28dM+后14dNS大鼠肺間質膠原面積百分比為分別為(0.46±0.01)，(1.8±0.11)。與28dNS+后

16、14dNS大鼠比較，28dM+后14dNS大鼠肺間質膠原面積增大（P＜0.001）。與28dM+后14dNS大鼠比，28dM+后14dBa大鼠肺間質膠原面積百分比(0.52±0.07)明顯減小（P＜0.001），且與28dNS+后14dNS大鼠的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 6.3羥脯氨酸檢測結果：28dNS+后14dNS大鼠、28dM+后14dNS大鼠肺內HYP含量分別為[(3.65±1.05)μg/mglungw

17、eight]和[(7.61±1.27)μg/mglungweight]。與28dNS+后14dNS大鼠比較，28dM+后14dNS大鼠肺內HYP含量顯著增高(P＜0.001)。與28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dBa大鼠肺內HYP含量[(4.45±1.11)μg/mglungweight]明顯降低(P＜0.001)，且與28dNS+后14dNS大鼠比，其差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 結論：1.在肺纖維

18、化的早期階段(1-14d)，Ba對模型大鼠肺MMP-13含量和活性及TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3活性的變化均無明顯的影響；對肺間質膠原面積的變化亦無明顯影響。
　　 2.在肺纖維化的晚期階段(14-28d)，Ba完全阻止了模型大鼠肺內MMP-13含量的減少和活性的降低，但對TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3活性的變化均無明顯影響。
　　 3.Ba阻止模型大鼠肺纖維化晚期肺間質膠原的增多。由此推測，Ba糾